兒童下呼吸道卡他莫拉菌的耐藥性研究

楊曉華， 譚 南， 林愛心， 張熾倫， 蔡鳳娟

卡他莫拉菌是導(dǎo)致兒童下呼吸道感染、中耳炎、上頜竇炎等的常見病原菌。隨著近年來抗菌藥物的大量使用，已有多重耐藥菌株報(bào)道出現(xiàn)[1-2]，且其耐藥性呈現(xiàn)越益嚴(yán)重的趨勢。本研究針對(duì)本院兒科門診和住院患兒痰液中的卡他莫拉菌分離株進(jìn)行抗生素敏感性檢測，了解其耐藥狀況，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2015年1月1日－2017年12月31日，在廣東省中山市博愛醫(yī)院兒科診斷為下呼吸道感染并進(jìn)行痰細(xì)菌培養(yǎng)的門診及住院患兒25 598例，其中門診患兒200例?；純褐心?5 810例，女9 788例。根據(jù)第7版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》年齡分組[3]：新生兒（≤28 d）1 139例，嬰兒（29 d～6個(gè)月）7 172例，＞6個(gè)月～1歲4 928例；＞1～3歲6 942例，＞3～6歲4 558例，＞6～14歲859例。季節(jié)分組：春季（3－5月份）7 204例，夏季（6－8月份）6 703例，秋季（9－11月份）5 778例，冬季（12月－次年2月份）5 913例。剔除同一患者重復(fù)送檢的標(biāo)本，只保留首次送檢的菌株。

1.1.2 儀器與試劑 VITEK 2-Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司；血平皿和巧克力平皿為廣州迪景微生物科技有限公司的產(chǎn)品；紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、四環(huán)素和阿莫西林-克拉維酸6種藥敏紙片購自英國OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與鑒定 6歲以下的患兒均采用在負(fù)壓下無菌操作抽吸深部痰液，置于痰液收集器2 h內(nèi)送檢。將合格痰液標(biāo)本（鱗狀上皮細(xì)胞＜10個(gè)/低倍視野，白細(xì)胞＞25個(gè)/低倍視野，每低倍鏡視野下白細(xì)胞/鱗狀上皮細(xì)胞＞2∶1）接種于血平皿、麥康凱平皿和巧克力平皿，置于35℃，5%～10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。可疑菌落涂片染色鏡檢，對(duì)初步判定為卡他莫拉菌的菌株同時(shí)用VITEK 2-Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的NH卡上機(jī)鑒定。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

1.2.2.1 紙片擴(kuò)散法（K-B法） 以MH瓊脂為培養(yǎng)基，0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)菌懸液均勻涂布，5%CO2培養(yǎng)箱，35℃孵育20～24 h。藥敏結(jié)果參照CLSI M45-A3標(biāo)準(zhǔn)判讀[4]。對(duì)紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素不敏感的菌株，復(fù)測一次藥敏，兩次結(jié)果相符才報(bào)告。兩次結(jié)果不相符的菌株用E試驗(yàn)法進(jìn)行驗(yàn)證。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923，大腸埃希菌ATCC 35218。

1.2.2.2 E試驗(yàn)法 配制0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)菌懸液均勻涂布在MH瓊脂平皿上，貼上含有紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素梯度濃度的E試驗(yàn)紙片，置5% CO2培養(yǎng)箱，35℃孵育20～24 h。在對(duì)紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素不敏感的卡他莫拉菌株中，隨機(jī)抽取20株卡他莫拉菌用E試驗(yàn)法確認(rèn)結(jié)果。

1.2.3 β內(nèi)酰胺酶檢測 用接種環(huán)挑取被檢菌，均勻涂布于潤濕的頭孢硝噻吩紙片上，10 min內(nèi)紙片顏色變紅即為陽性，表示該菌株產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶，不變色為陰性。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 WHONET 6.0軟件進(jìn)行藥敏結(jié)果的統(tǒng)計(jì)。使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卡他莫拉菌分離率的變化情況

25 598例患兒痰標(biāo)本中，分離出卡他莫拉菌共3 055株，總分離率為11.93%，2015－2017年1－12月的卡他莫拉菌分離率變化情況見圖 1。11月－次年2月檢出率高，秋冬季為高發(fā)。

圖1 2015－2017年兒童卡他莫拉菌月分離率Figure 1 Prevalence of Moraxella catarrhalis in sputum by month from 2015 through 2017

2.2 卡他莫拉菌檢出的相關(guān)因素及檢出率

卡他莫拉菌感染患兒中，男1 8 3 3例（1 833/15 810，11.59%），女1 222例（1 222/9 788，12.48%），女童感染率略高于男童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.84，P=0.028）。不同季節(jié)細(xì)菌檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=246.40，P＜0.05），其中冬、夏兩季檢出率呈明顯對(duì)比，前者最高，后者最低。6組不同年齡段陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=295.74，P＜0.05）。年齡分組中細(xì)菌檢出率最高的是＞1～3歲組，＞3～6歲組次之，最低的是≤28 d組。見表1。

2.3 卡他莫拉菌藥敏結(jié)果

表1 不同年齡段卡他莫拉菌分離菌株數(shù)Table 1 The prevalence of Moraxella catarrhalis in sputum in terms of age group

表2 卡他莫拉菌對(duì)抗菌藥物的敏感率和耐藥率Table 2 Susceptibility of Moraxella catarrhalis strains to antimicrobial agents（%）

2.4 卡他莫拉菌合并其他菌株多重感染情況

在檢出3 055株卡他莫拉菌的感染患兒中，單一感染1 710例，占55.97%，混合其他細(xì)菌感染1 345例，占44.03%，其中以肺炎鏈球菌的混合感染比例最高，達(dá)35.69%，其次為流感嗜血桿菌（28.25%）和金黃色葡萄球菌（15.99%），兩種細(xì)菌同時(shí)感染的分組中，流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌感染率最高，占5.65%。見表3。

3 討論

卡他莫拉菌又名卡他微球菌，過去一直認(rèn)為其對(duì)人體無致病性。隨研究深入發(fā)現(xiàn)，卡他莫拉菌菌體可以刺激呼吸道上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌炎性因子，引起呼吸道炎癥從而引發(fā)一系列呼吸道癥狀[5]。

表3 卡他莫拉菌合并其他菌株的感染情況Table 3 The pathogens in mixed infection of Moraxella catarrhalis

本研究中，卡他莫拉菌分離率為11.93%，與寧夏銀川、湖北、河北[6-8]的報(bào)道結(jié)果較一致，高于四川中江[9]，表明卡他莫拉菌的檢出率存在地域性差異。對(duì)卡他莫拉菌檢出相關(guān)因素分析顯示，感染患兒性別相比較，女童感染率略高于男童。而年齡分組中，＞1～3歲組細(xì)菌檢出率最高，＞3～6歲組次之，≤28 d組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示1～6歲兒童是卡他莫拉菌感染的高危人群，原因可能是：①該年齡段兒童，失去來自母體抗體的保護(hù)，自身呼吸系統(tǒng)免疫功能發(fā)育還不完全，自身免疫力低下；②卡他莫拉菌的定植量較大，所以患兒在黏膜屏障受損時(shí)易被該菌感染。但隨著小兒年齡增長，其免疫系統(tǒng)逐步發(fā)育成熟，黏膜抵御細(xì)菌感染的能力也隨之增強(qiáng)。6歲以上的兒童感染率明顯降低。卡他莫拉菌在每年的11月、12月、次年1月和2月份分離率明顯比其他月份高，說明季節(jié)是影響卡他莫拉菌分離率的重要因素。原因可能是卡他莫拉菌受寒冷刺激，延長了信使RNA半衰期，使其主要黏附分子普遍存在的表面蛋白1表達(dá)增加，進(jìn)而提高了黏附呼吸道上皮細(xì)胞的能力，毒力也增強(qiáng)[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)卡他莫拉菌陽性患兒同時(shí)分離出其他病原菌的情況較為多見，復(fù)數(shù)菌感染率為44.03%，單一菌感染率為55.97%，二者比值接近1∶1，其中肺炎鏈球菌混合感染的比例最高，為35.69%，其次為流感嗜血桿菌28.25%，同時(shí)混合兩種菌感染的比例較小，主要為肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。有研究顯示，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的卡他莫拉菌混合感染其他病原菌株時(shí)，卡他莫拉菌不僅可以保護(hù)自身不被殺滅，還可以保護(hù)對(duì)抗菌藥物敏感的病原菌不被殺滅，使其發(fā)揮致病作用[11]；同時(shí)當(dāng)機(jī)體感染一種菌導(dǎo)致免疫力下降時(shí)，其他細(xì)菌也會(huì)趁虛而入，從而引發(fā)多重混合感染[12-13]。由此可見，卡他莫拉菌陽性不論是單一感染或是混合感染，都有重要的臨床意義。臨床醫(yī)師在抗感染治療時(shí)，應(yīng)考慮混合感染的情況，并幫助增強(qiáng)患兒免疫力以預(yù)防混合感染的出現(xiàn)。

卡他莫拉菌耐藥的主要原因是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶，產(chǎn)酶率不斷增加是一個(gè)嚴(yán)重的問題，本次檢測陽性率為93.0%，略低于全國和北京的報(bào)道[1-2]。本研究顯示，卡他莫拉菌對(duì)甲氧芐啶-磺胺甲唑、四環(huán)素、阿莫西林-克拉維酸有90%以上的敏感率，由于兒童不宜使用磺胺類和四環(huán)素類藥物，阿莫西林-克拉維酸和頭孢噻肟等第三代頭孢菌素可作為治療卡他莫拉菌感染經(jīng)驗(yàn)用藥的首選藥物。

現(xiàn)行的CLSI M45-A3文件對(duì)紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素只有敏感的折點(diǎn)而無耐藥和中介的折點(diǎn)。本組資料顯示，卡他莫拉菌對(duì)這3種抗生素不敏感率分別為30.3%、38.2%和29.8%。從不敏感菌株中隨機(jī)選取20株，用E試驗(yàn)法對(duì)紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，結(jié)果顯示這3種抗生素對(duì)20株受試卡他莫拉菌的MIC值均≥8 mg/L，與K-B法獲得的不敏感結(jié)果一致。CHINET報(bào)道卡他莫拉菌對(duì)阿奇霉素的不敏感率由2006年的41.2%增至2013年的57.8%[2]；鄭紅艷等[1]報(bào)道對(duì)紅霉素和阿奇霉素不敏感率甚至高達(dá)82.5%和83.1%；雖然我國各個(gè)地區(qū)存在不敏感率差異，但卡他莫拉菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的不敏感率呈上升趨勢是個(gè)不爭的事實(shí)，應(yīng)引起臨床的足夠重視。應(yīng)堅(jiān)持監(jiān)測卡他莫拉菌的感染及耐藥情況，根據(jù)藥敏結(jié)果選擇針對(duì)性的藥物。

綜上，兒童作為卡他莫拉菌感染的高危人群，尤其是好發(fā)于秋冬季節(jié)和1～6歲年齡段兒童的下呼吸道感染，臨床醫(yī)師應(yīng)予以重視和警惕，同時(shí)針對(duì)感染患者應(yīng)合理用藥，及時(shí)控制和預(yù)防病情。了解卡他莫拉菌的分離、感染情況和耐藥性，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重大意義。