奈諾沙星對脂多糖誘導炎性反應(yīng)的免疫調(diào)控作用

趙 旭， 李 鑫， 張 菁， 郭蓓寧

喹諾酮類抗菌藥物具抗菌譜廣、抗菌活性強、不良反應(yīng)少、組織滲透性強等特征，為治療呼吸道感染、尿路感染等感染性疾病的常用抗菌藥物，有環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星等[1]。近年來開發(fā)了不含氟的新型喹諾酮類抗菌藥物，且仍具有強大的抗菌活性，奈諾沙星是其中的代表[2]。它具有廣譜抗菌活性，對各種革蘭陽性菌和陰性菌、厭氧菌及非典型病原體均有良好抗菌作用[3]。目前該藥已經(jīng)上市。

近年來對抗菌藥物的研究顯示，抗菌藥物一方面可以直接對病原菌起到殺菌或抑菌作用，另一方面也可通過調(diào)節(jié)宿主免疫功能清除病原菌，保護宿主的重要臟器功能[4]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類抗菌藥物對宿主的非特異性和特異性免疫均有調(diào)控作用。如加替沙星能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬作用并提高細胞內(nèi)殺菌能力[5]。在脂多糖（LPS）誘導的內(nèi)毒素血癥小鼠模型中，環(huán)丙沙星可以抑制宿主產(chǎn)生的腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6等炎癥前細胞因子，從而抑制LPS誘導的炎性反應(yīng)[6-7]。然而，本研究以奈諾沙星為研究對象，采用體外細胞學實驗和體內(nèi)動物實驗來研究奈諾沙星對LPS誘導炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 RAW264.7細胞是小鼠單核巨噬細胞系，購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.2 試劑 奈諾沙星標準品由浙江醫(yī)藥提供；DMEM培養(yǎng)液（高糖）購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素雙抗、LPS 、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；類胎牛血清購自美國HyClone公司；96孔酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 實驗動物 C57BL/C小鼠50只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量20～25 g，雄性，合格證號為SCXK（滬）：2017-0002，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)溫度18～25℃，相對濕度50%～70%。

1.2 方法

1.2.1 體外細胞學實驗方法 自-80℃冰箱中取出RAW264.7細胞，加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基（含青霉素、鏈霉素雙抗），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培育至生長約80%傳代，取4～5 代生長狀態(tài)良好的細胞，以5×105/mL的密度接種于12孔板中培育至約80%進行LPS誘導炎性反應(yīng)。在實驗當天吸去細胞培養(yǎng)基隨即加入新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)基后孵育2 h，然后按不同組別加入奈諾沙星、LPS進行孵育。實驗分為4組，組1：奈諾沙星+LPS組，先將400 μg/mL奈諾沙星溶液20 μL加入2 mL細胞培養(yǎng)基（奈諾沙星終濃度為4 μg/ mL），2 h后再加入1 μg/mL LPS 20 μL（LPS終濃度為10 ng/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；組2：LPS組，僅加入1 μg /mL LPS 20 μL；組3：奈諾沙星組，僅加入400 μg/mL奈諾沙星20 μL；組4：空白對照組，不加奈諾沙星和LPS。在加入LPS后3 h、6 h、12 h、24 h分別收集4組的細胞培養(yǎng)上清液置-80℃保 存。

1.2.2 低劑量LPS誘導小鼠內(nèi)毒素血癥模型及奈諾沙星干預 將30只小鼠隨機分為6組，每組5只。組 1：奈諾沙星10 mg/kg+LPS組，在實驗當日小鼠腹腔注射奈諾沙星10 mg/kg，2 h后腹腔注射LPS 5 mg/kg；組2：奈諾沙星40 mg/kg+LPS組，小鼠腹腔注射奈諾沙星40 mg/kg，2 h后腹腔注射LPS 5 mg/ kg；組3：奈諾沙星10 mg/kg組，只注射奈諾沙星10 mg/kg，不注射LPS；組4：奈諾沙星40 mg/ kg組，只注射奈諾沙星40 mg/kg，不注射LPS；組5：LPS組，只注射LPS，不注射奈諾沙星；組6：空白對照組，不注射LPS和奈諾沙星。在注射LPS后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h每組小鼠均眼眶取血，并立即離心取血清，置于-20℃保存。

1.2.3 細胞因子檢測 采用ELISA 方法測定上述細胞培養(yǎng)上清液和小鼠血清中IL-6、IL-10以及TNF-α含量，按照ELISA試劑盒操作說明書進行檢 測。

1.2.4 奈諾沙星對高劑量LPS致小鼠死亡的保護作用 20只小鼠隨機分為4組，每組5只。組 1：LPS 12.5 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS 12.5 mg/ kg，2 h后注射0.9% NaCl溶液，1次/12 h作為對照；組2：奈諾沙星+LPS 12.5 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS 12.5 mg/kg，2 h后腹腔注射奈諾沙星40 mg/kg，1 次 /12 h，用藥和觀察兩組小鼠的死亡至72 h；組3：LPS 25 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS劑量改為25 mg/kg，余操作同組1；組4：奈諾沙星+LPS 25 mg/kg組，每只小鼠腹腔注射LPS劑量改為25 mg/ kg，余操作同組 2。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用GraphPadPrism 5.0 進行死亡率作圖和分析。數(shù)據(jù)整理后，實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組之間計量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，兩組之間死亡率采用Fisher精確檢驗法。

2 結(jié)果

2.1 體外奈諾沙星對LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子的干預

檢測顯示，LPS組和奈諾沙星+LPS組IL-6水平均隨時間延長明顯升高，其中12 h達最高峰。奈諾沙星+LPS組在3 h、6 h、12 h的 IL-6水平比LPS組低，其中3 h和6 h點兩組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 6和P=0.003 5）（圖1A）。對TNF-α檢測，奈諾沙星+LPS組在3 h TNF-α水平比LPS組明顯降低，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007 9），但在6 h和12 h奈諾沙星+LPS組與LPS組基本相仿（圖1B）。與IL-6和TNF-α等促炎細胞因子不同，IL-10系抑炎細胞因子，IL-10表達量越高對炎癥的抑制作用越強。奈諾沙星+LPS組和LPS組的IL-10水平也隨著時間延長而明顯升高，在3 h時兩組基本相似，但在6 h和12 h奈諾沙星+LPS組較LPS組IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.005和0.034）（圖1C）。無論哪一種細胞因子，奈諾沙星組和空白對照組的細胞因子水平基本均為0，提示無LPS存在時，奈諾沙星本身對巨噬細胞無刺激或抑制作用。

圖1 ELISA 方法測定4組巨噬細胞上清液中細胞因子含量Figure 1 Cytokine levels in macrophage supernatant determined by ELISA after different treatments

2.2 奈諾沙星對低劑量LPS誘導的小鼠內(nèi)毒素血癥的影響

在低劑量LPS（5 mg/kg）誘導小鼠內(nèi)毒素血癥模型中，無論LPS組、奈諾沙星10 mg/kg+LPS組或奈諾沙星40 mg/kg+LPS組，IL-6、TNF-α及IL-10水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。對于IL-6，LPS組與兩組奈諾沙星+LPS組的水平均在1～3 h呈上升趨勢，至3 h達最高峰，之后迅速下降，至12 h基本為0；在1 h和3 h，兩組奈諾沙星+LPS組與LPS組基本相仿，但在6 h奈諾沙星10 mg/kg+LPS組及奈諾沙星40 mg/kg+LPS組IL-6水平較LPS組明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.005和0.006）（圖2A）。TNF-α水平峰值出現(xiàn)更早，在1 h即出現(xiàn)最高峰，之后迅速下降，至6 h基本為0；但在1 h和3 h，奈諾沙星10 mg/kg+LPS組及奈諾沙星40 mg/kg+LPS組較LPS組TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（1 h時P值分別為0.047和0.037，3 h時P值分別為0.022和0.021）（圖2B）。三組IL-10水平均在1 h出現(xiàn)峰值，之后不斷下降，至12 h基本為0；在1 h奈諾沙星10 mg/kg+LPS組及奈諾沙星40 mg/ kg+LPS組IL-10水平均較LPS組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.005和0.002）；其中在1 h時奈諾沙星40 mg/kg+LPS組IL-10水平較奈諾沙星10 mg/ kg+LPS組更高，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.073）（圖2C）；奈諾沙星40 mg/ kg+LPS組與10 mg/kg+LPS組在其余各時間點各種細胞因子水平基本相仿。與體外細胞學實驗結(jié)果相似，兩組奈諾沙星組與空白對照組檢測到的細胞因子水平基本均為0，提示無LPS存在時，奈諾沙星本身對小鼠血清細胞因子水平無調(diào)控作用。

2.3 奈諾沙星對高劑量LPS致小鼠死亡的保護作 用

奈諾沙星+LPS 25 mg/kg組和LPS 25 mg/ kg組的小

鼠死亡率均為100%。奈諾沙星+LPS 12.5 mg/ kg組小鼠無死亡；LPS 12.5 mg/kg組在36 h有1只小鼠死亡，在60 h有2只小鼠死亡，總死亡率3/5，提示奈諾沙星對LPS引起的內(nèi)毒素血癥致小鼠死亡有保護作用。兩組死亡率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.080）。奈諾沙星+LPS 12.5 mg/kg組和LPS 12.5 mg/kg組兩組生存曲線比較，見圖 3。

圖2 ELISA 方法測定6組小鼠血清中細胞因子含量Figure 2 Serum level of cytokines determined by ELISA in mice after different treatments

圖3 注射高劑量LPS（12.5 mg/kg）后兩組小鼠的生存率Figure 3 The survival rate of mice after treatment with LPS（12.5 mg/kg）alone and LPS+nemonoxacin

3 討論

作為一種不含氟的新型喹諾酮類抗菌藥物，奈諾沙星對于臨床上治療較為困難的耐藥菌如甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）、青霉素耐藥肺炎鏈球菌（PRSP）、糞腸球菌等的抗菌作用優(yōu)于其他喹諾酮類。既往對該藥的研究主要集中在作用機制、抗菌活性、藥動學和藥效學等方面[8-11]，未涉及對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用。

本實驗采用體外細胞學實驗和體內(nèi)動物實驗研究奈諾沙星對LPS誘導炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。體外實驗選擇巨噬細胞作為LPS誘導炎性反應(yīng)的作用細胞，這是鑒于巨噬細胞構(gòu)成機體防御病原微生物感染的第一道防線，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。而且巨噬細胞通過識別、吞噬及抗原遞呈清除抗原性異物，同時通過分泌TNF-α、IL-6 等炎性因子及IL-8 等趨化因子，促進急性期免疫反應(yīng)，加速對病原體的清除[12]。對喹諾酮類體外免疫調(diào)節(jié)機制的研究中多有采用LPS誘導巨噬細胞這一感染模型[13-14]。而動物實驗研究喹諾酮類對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，也常采用腹腔注射LPS誘導小鼠引起內(nèi)毒素血癥這一模型[15]。因為LPS無細胞結(jié)構(gòu)，而引起的機體炎性反應(yīng)強烈，抗菌藥物對其沒有作用，故而此模型非常適合應(yīng)用于研究抗菌藥物的免疫調(diào)控作用機制。

奈諾沙星的臨床藥動學結(jié)果顯示，健康志愿者單次服用500 mg奈諾沙星后，血藥峰濃度（Cmax）為5.91 μg/mL[16]，據(jù)此本研究選擇細胞學實驗?zāi)沃Z沙星的濃度為4 μg/mL，與單劑口服奈諾沙星的Cmax基本相似。實驗結(jié)果顯示在無LPS誘導的情況下，奈諾沙星對巨噬細胞無作用。但是當LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生炎性反應(yīng)，IL-6、TNF-α等前炎性因子明顯升高時，奈諾沙星對這兩種促炎因子均顯示為抑制作用，而對IL-10抑炎因子則顯示為促進作用。對氟喹諾酮類的其他品種也有許多體外實驗的相關(guān)研究，但各種不同品種氟喹諾酮類對LPS刺激單核/巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子的調(diào)控作用不完全相同。如5～20 μg/ mL的莫西沙星對LPS刺激THP-1 細胞產(chǎn)生的IL-8抑制作用達26%～40%，對TNF-α抑制作用達14%～51%，對IL-1β的抑制作用達50%～83%[17]。而本實驗結(jié)果也顯示奈諾沙星對促炎因子有抑制作用，對抑炎因子有促進作用。這一作用在抗感染治療中可能具有積極意義。這是因為TNF-α等雖然能刺激單核巨噬細胞及其他細胞分泌趨化細胞因子，引起白細胞在炎癥部位的聚集，從而吞噬或殺滅病原微生物。但過量的細胞因子?？蓪е逻^度免疫反應(yīng)，如過量TNF-α分泌入血可引起多臟器和免疫系統(tǒng)的損害，而過量IL-6常作為內(nèi)源性致熱源引起宿主發(fā)熱[18-19]。因此，奈諾沙星等喹諾酮類抗菌藥物對LPS誘導巨噬細胞發(fā)生強烈炎性反應(yīng)時能抑制IL-6、TNF-α等細胞因子的產(chǎn)生，可以在一定程度上抑制機體過度的免疫反應(yīng)，保護宿主重要臟器功能。

動物實驗的結(jié)果與細胞學實驗結(jié)果類似，且在動物水平驗證了奈諾沙星可以抑制LPS誘導的炎性反應(yīng)，對機體有保護作用，同時能降低LPS引起的內(nèi)毒素血癥的死亡率。而奈諾沙星+LPS 25 mg/ kg組和LPS 25 mg/kg組，兩組小鼠全部死亡，這可能由于LPS劑量過大，內(nèi)毒素血癥過于嚴重，奈諾沙星免疫介導作用不足以挽救小鼠生命。在奈諾沙星+LPS 12.5 mg/kg組，小鼠無死亡，而LPS 12.5 mg/kg組總體死亡3/5，由于本次動物實驗樣本量較小，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.08），但結(jié)果仍可提示奈諾沙星能降低因LPS引起嚴重內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡。其他氟喹諾酮類抗菌藥物也有類似的免疫保護作用。如小鼠腹腔注射4.5 mg或6 mg環(huán)丙沙星，再注射1 mg LPS，小鼠無死亡 ，而LPS組小鼠死亡率為100%[7]。本研究低劑量實驗結(jié)果顯示，在無LPS誘導的情況下，奈諾沙星對宿主免疫系統(tǒng)無作用，但是當腹腔注射LPS無論奈諾沙星10 mg/kg+LPS或奈諾沙星40 mg/kg+LPS組小鼠血清中的IL-6（6 h）、TNF-α（1 h和3 h）水平均明顯低于LPS組小鼠；而抑炎因子IL-10（1 h）則升高，高于LPS組。提示LPS致小鼠膿毒血癥實驗中，奈諾沙星對IL-6、TNF-α均顯示為抑制作用，而對IL-10則顯示促進作用。

以上研究結(jié)果顯示，奈諾沙星作為一種新型不含氟的喹諾酮類抗菌藥物，與許多氟喹諾酮類藥物相似，除了抗菌作用外，對宿主感染具有免疫調(diào)節(jié)作用，而且此免疫調(diào)節(jié)作用是正向的、積極的，可以抑制宿主產(chǎn)生的過度免疫反應(yīng)，這將有助于改善重癥感染性疾病免疫功能，并可能提高疾病治療的有效性。