平喘方對(duì)哮喘模型小鼠pDC/cDC通路的干預(yù)作用研究

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院 江 蘇，無(wú)錫 2 14001 2.上海市中醫(yī)醫(yī)院

哮喘是小兒常見(jiàn)肺系疾病，中醫(yī)認(rèn)為哮喘的發(fā)生機(jī)制是“內(nèi)有壅塞之氣，膈有膠固之痰，外有非時(shí)之感，三者相合，閉拒氣道，搏擊有聲，發(fā)為哮喘”[1]。平喘方是全國(guó)名老中醫(yī)虞堅(jiān)爾教授在徐氏兒科第三代傳人朱瑞群教授臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合自身學(xué)術(shù)特點(diǎn)而創(chuàng)制的，該方立足于哮喘發(fā)病之本——“伏痰夙瘀”，標(biāo)本兼治，宣肺降氣以定其喘，化痰以治其本，兼化瘀以撼其根，以恢復(fù)肺之宣降功能，達(dá)到平喘之目的，臨床療效顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)，平喘方可以影響T細(xì)胞的分化，從而減輕氣道炎癥[2]，但是其具體作用環(huán)節(jié)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在考察平喘方對(duì)哮喘模型小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）的兩種亞型即漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）和傳統(tǒng)DC（conventional DC，cDC）的平衡的干預(yù)作用，探討其對(duì)T細(xì)胞分化的影響環(huán)節(jié)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠40只，4～6周齡，體質(zhì)量16～18g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2014-0008]。所有小鼠均在室溫22℃、濕度50%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食。

1.2中藥 由上海萬(wàn)仕誠(chéng)國(guó)藥制品有限公司提供。

1.3主要試劑和儀器 地塞米松購(gòu)于上海信宜有限公司（批號(hào)：110302）；雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）購(gòu)于上海駿惠化工有限公司（批號(hào)：20120418）；ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒由RD公司進(jìn)口分裝（批號(hào)：20171205）；10%甲醛、TEMED及HE染色劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：20120320、ST728、20170927）；山羊血清封閉液、DAB顯色試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）、HRP標(biāo)記的抗生物素抗體、電泳緩沖液、Marker、PBS緩沖液、二抗均購(gòu)于碧云天生物科技有限公司 （批號(hào)：P0102、ST033、P0010、P0211、P0021A、P0067、ST-476、A0216）；47kDa 叉頭蛋白 P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）抗體購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司（批號(hào)：20171101）；52kDa維甲酸相關(guān)孤兒受體（retinoid-related orphan nuclear receptor，RORγt）抗體購(gòu)于美國(guó) Millipore公司（批號(hào)：20171018）；Masson染色劑購(gòu)于南京建成科技有限公司（批號(hào)：171615）；cDNA合成試劑盒購(gòu)于Fermentas公司（批號(hào)：20171112）；Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司（批號(hào)：20170125）；Real-time PCR Mix購(gòu)于美國(guó)ABI公司（批號(hào)：20170502）。

RM2235石蠟切片機(jī)購(gòu)于Leica公司；BX51型熒光顯微鏡購(gòu)于Olympus公司；ABI-7500型PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；Mini PROTEAN 3 cell電泳儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品；PS-9電轉(zhuǎn)儀購(gòu)于大連競(jìng)邁科技有限公司。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組及模型制備 將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、地米組和平喘方組，每組10只。10%OVA致敏液由10g OVA、1g氫氧化鋁、100mL蒸餾水配成，即配即用。除空白組外，其他3組小鼠按50mL/kg的劑量腹腔注射10%OVA致敏液，空白組腹腔注射相同劑量的0.9%氯化鈉溶液，每2周1次，共注射2次。末次注射1周后，除空白組外，其他3組小鼠均以5g OVA+100mL蒸餾水配制的5%OVA進(jìn)行致敏霧化，空白組采用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行霧化，每次40min，1次/d，共1周。

1.4.2藥物制備 平喘方方劑組成：炙麻黃5g、苦杏仁 10g、炙甘草 5g、炙蘇子 10g、萊菔子 10g、大桃仁10g、淡子芩10g等。藥物參考李儀奎[3]《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》及臨床實(shí)際應(yīng)用的方法煎煮提取，第1次加13倍水旺火煮沸后，溫火煮30min，將藥液濾出；第2次加入11倍水旺火煮沸后，溫火煮30min，將藥液濾出。將2次濾液合并濃縮，加入適量95%乙醇，乙醇具體加入量依據(jù)公式V×60/（95-60）計(jì)算。冷藏靜置24h后濾出，將濾液濃縮至流浸膏樣，配制至生藥濃度 5.33g·mL-1。

1.4.3給藥方法 各組小鼠于致敏霧化當(dāng)天開(kāi)始用藥，平喘方組按1.4.2中的濃度，以20mL/kg·d的劑量灌胃；空白組和模型組以等劑量蒸餾水灌胃；地米組以蒸餾水將地塞米松片配制成濃度為0.075mg·mL-1的溶液，按等劑量灌胃。

1.4.4氣道炎癥指標(biāo)檢測(cè)

1.4.4.1ELISA法檢測(cè)小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎癥因子的含量各組灌胃1周后處死小鼠，收集BALF，以ELISA法測(cè)定白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、白細(xì)胞介素-23（interleukin-23，IL-23） 及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的含量。

1.4.4.2Western blot檢測(cè)小鼠肺組織中 RORγt、FOXP3的蛋白表達(dá) 各組灌胃1周后處死小鼠，分離右側(cè)肺組織，采用Western blot檢測(cè)肺組織中RORγt、FOXP3的蛋白表達(dá)量。

1.4.4.3Real-time PCR檢測(cè)小鼠肺組織中吲哚胺-2，3-二氧化酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）、腫瘤壞死因子超家族4（tumor necrosis factor superfamily4，TNFSF4）的基因表達(dá) 各組灌胃1周后處死小鼠，分離右側(cè)肺組織，以Real-time PCR檢測(cè)肺組織中IDO、TNFSF4的基因表達(dá)。反應(yīng)體系如下：將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系總體積50μL，具體組成如下：Real-time PCR Mix 32.0μL、IDO、TNFSF4、上下 游 引 物 各 0.5μL、TaqMan Probe0.5μL、ddH2O 14.5μL、cDNA 模板 2μL。反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃15s，60℃45s（采集熒光），共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物均由上海捷瑞生物工程公司設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)表1。

1.4.5氣道重建指標(biāo)檢測(cè) 各組灌胃1周后處死小鼠，取左側(cè)肺組織放入凍存管中，以10%甲醛固定，以備切片。將肺組織進(jìn)行Masson染色，鏡下檢測(cè)膠原蛋白面積，以及支氣管基底膜周長(zhǎng)（perimeter of bronchial basement membrane，Pbm）、支氣管壁面積（bronchial wall area，Wat）和氣道平滑肌面積（airway smooth muscle area，Wam）。400倍光學(xué)顯微鏡下挑選3支有完整橫斷面的中小支氣管，采用圖像采集系統(tǒng)獲取圖像，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量Pbm、支氣管總面積（Wat1）、管腔面積（Wat2）、平滑肌外緣內(nèi)氣道面積（Wam1）、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣道面積（Wam2），并用 Pbm 標(biāo)準(zhǔn)化，分別以（Wam1-Wam2）/Pbm和（Wat1-Wat2）/Pbm來(lái)計(jì)算氣道平滑肌面積（airway smooth muscle area，WAm）和氣道內(nèi)壁面積（airway inner wall area，WAi）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，服從正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，組間比較采用方差分析及LSD多重比較，若方差不齊則先進(jìn)行轉(zhuǎn)換，再采用方差分析及LSD多重比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況比較 空白組小鼠呼吸均勻，活動(dòng)正常，毛皮順滑干燥，二便正常，進(jìn)食及飲水正常。模型組霧化激發(fā)后出現(xiàn)呼吸急促，腹肌抽搐，抓撓皮膚，二便失禁，毛發(fā)豎起、潮濕欠光澤，驚恐易激惹等現(xiàn)象，飲食及活動(dòng)減少。平喘方組和地米組小鼠毛色稍順，活動(dòng)自如，平喘方組體重增加，地米組體重稍有減輕。

2.2各組小鼠肺組織病理學(xué)改變比較 空白組支氣管壁結(jié)構(gòu)完整光滑，細(xì)胞排列整齊，管腔內(nèi)及管周未見(jiàn)明顯異常表現(xiàn)。模型組支氣管變形，管徑變窄，呈現(xiàn)菊花樣改變，管腔內(nèi)有大量的炎性滲出物，管周有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及堆積。地米組支氣管壁結(jié)構(gòu)完整，管周有少許的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。平喘方組支氣管管徑正常，管壁結(jié)構(gòu)稍有破損，管腔內(nèi)及管周有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.3用藥1周后各組小鼠BALF中IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的含量比較 與空白組比較，模型組BALF中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 含量均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組的 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 含量均減低（P＜0.05）。與地米組比較，除IL-17外，平喘方組其他指標(biāo)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片（HE染色，400×）Fig.1 Pathological sections of lung tissue in each group(HE staining，400×)

表2 各組小鼠 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 的含量比較（±s）Tab.2 Comparison of the contents of IL-6,IL-17,IL-23 and TGF-β in BALF in each group(±s)

表2 各組小鼠 BALF 中 IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β 的含量比較（±s）Tab.2 Comparison of the contents of IL-6,IL-17,IL-23 and TGF-β in BALF in each group(±s)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與地米組比較，△P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05；compared with dexamethasone group，△P＜0.05

13.91±11.3 6 114.31±2 8.31 * 2 3.94±14.61*#60.16±30.84*#△組別 n IL-6（ng·L-1） IL-17（pg·mL-1） IL-23（pg·mL-1） TGF-β（ng·L-1）空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 4.85±2.42 83 .35±19.28*12.90±5.64*#32.3 7±23.19*#△2.97±1.2 8 48.13±7.36*16.03±8.99*#14.80±7.53*#7.46±4.61 121 .70±28.46*13.74±6.01*#35.16±15.35*#△

2.4用藥1周后各組小鼠肺組織中RORγt和FOXP3的蛋白表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組肺組織中RORγt蛋白表達(dá)量增高，F(xiàn)OXP3表達(dá)量減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組肺組織中RORγt蛋白表達(dá)量減低，F(xiàn)OXP3表達(dá)量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與地米組比較，平喘方組RORγt和FOXP3蛋白表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 3、圖 2。

2.5用藥1周后各組小鼠肺組織中IDO和TNFSF4基因表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組肺組織中IDO的基因表達(dá)量降低，TNFSF4的基因表達(dá)量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組肺組織中IDO基因表達(dá)量增高，TNFSF4基因表達(dá)量的基因表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與地米組比較，平喘方組中的IDO、TNFSF4基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表3 各組小鼠肺組織中RORγt和FOXP3蛋白表達(dá)量比較（±s）Tab.3 Comparison of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group（±s）

表3 各組小鼠肺組織中RORγt和FOXP3蛋白表達(dá)量比較（±s）Tab.3 Comparison of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

0.78±0.15 0.43±0.10*0.65±0.10*#0.59±0.09*#組別 n RORγt FOXP3空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 0.46±0.12 0.78±0.06*0.60±0.09#0.65±0.08*#

圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織RORγt和FOXP3蛋白表達(dá)Fig.2 Detection of RORγt and FOXP3 protein expression of lung tissue in each group by Western blot

2.6指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

2.6.1IL-17與RORγt、FOXP3之間的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析提示，IL-17與RORγt呈正相關(guān)，與FOXP3呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表5。

2.6.2IL-23 與 RORγt、FOXP3、TNFSF4 和 IDO 之間的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析提示，IL-23與RORγt呈正相關(guān)，與FOXP3呈負(fù)相關(guān)；與TNFSF4呈正相關(guān)，與IDO呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表6。

表4 各組小鼠肺組織中IDO和TNFSF4基因表達(dá)量比較（±s）Tab.4 Comparison of IDO and TNFSF4 gene expression of lung tissue in each group（±s）

表4 各組小鼠肺組織中IDO和TNFSF4基因表達(dá)量比較（±s）Tab.4 Comparison of IDO and TNFSF4 gene expression of lung tissue in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

0.26±0.17 1.3 2±0.29*0.52±0.18*#0.42±0.21#組別 n IDO TNFSF4空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 1.84±0.42 0.41±0.07*1.5 3±0.62 # 1.2 1±0.57#

表5 IL-17與RORγt、FOXP3的相關(guān)性分析Tab.5 Analysis of correlation between IL-17 and RORγt,FOXP3

2.6.3RORγt與TNFSF4、IDO之間的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析提示，RORγt與TNFSF4呈正相關(guān)，與IDO呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表7。

表6 IL-23 與 RORγt、FOXP3、TNFSF4、IDO 的相關(guān)性分析Tab.6 Analysis of correlation between IL-23 and RORγt,FOXP3,TNFSF4,IDO

表7 RORγt與TNFSF4,IDO的相關(guān)性分析Tab.7 Analysis of correlation between RORγt and TNFSF4,IDO

2.6.4FOXP3與TNFSF4、IDO之間的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析提示，F(xiàn)OXP3與TNFSF4呈負(fù)相關(guān)，與IDO呈正相關(guān)。見(jiàn)表8。

2.7用藥1周后各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積比較 與空白組比較，模型組、地米組、平喘方組的肺組織中膠原蛋白面積增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組的肺組織中膠原蛋白面積減低（P＜0.05）。與地米組比較，平喘方組的肺組織中膠原蛋白面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 9、圖 3。

表8 FOXP3與TNFSF4、IDO的相關(guān)性分析Tab.8 Analysis of correlation between FOXP3 and TNFSF4,IDO

表9 各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積比較(±s，%)Tab.9 Comparison of collagen area of lung tissues in each group(±s，%)

表9 各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積比較(±s，%)Tab.9 Comparison of collagen area of lung tissues in each group(±s，%)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：Compared with blank group，*P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05

組別n 膠原蛋白面積17.60±2.07 38.00±2.92 * 2 6.40±3.36*#29.00±3.39*#空白組模型組地米組平喘方組5 5 5 5

2.8用藥1周后各組小鼠肺組織中WAm、WAi比較與空白組比較，模型組肺組織WAm和WAi均增大（P＜0.01），地米組WAm和WAi差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），平喘方組 WAm 增大（P＜0.01），而 WAi差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，地米組、平喘方組的WAm和WAi均減?。≒＜0.01）。與地米組比較，平喘方組小鼠肺組織中WAm和WAi差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表10。

3 討論

自從1969年研究發(fā)現(xiàn)氣道中嗜酸粒細(xì)胞的增多是由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)以來(lái)，隨著氣道炎癥學(xué)說(shuō)的發(fā)展，輔助性T淋巴細(xì)胞Th1/Th2亞群比例和功能失衡成為哮喘的經(jīng)典發(fā)病機(jī)制。Th17是一種特殊的T細(xì)胞功能群，由該群細(xì)胞分泌的前炎性因子IL-17而命名，可以調(diào)節(jié)自身免疫、炎癥和黏膜的防御反應(yīng)。IL-17可以促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞的募集并促進(jìn)組織炎癥的發(fā)生。Th17細(xì)胞本身不會(huì)引起嗜酸性細(xì)胞增多，從而導(dǎo)致氣道炎癥，但是IL23-Th17細(xì)胞軸可以加強(qiáng)Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答介導(dǎo)的氣道炎癥。Treg細(xì)胞是一類(lèi)抑制性T細(xì)胞，其在維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)效應(yīng)T應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞起源于同一前體細(xì)胞，F(xiàn)OXP3和RORγt分別是Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子及種系特異性標(biāo)志[4]，而FOXP3和RORγt的平衡也決定T細(xì)胞的分化類(lèi)型，兩者均由TGF-β啟動(dòng)。DC是具有抗原遞呈功能的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞。氣道內(nèi)存在兩類(lèi)DC，cDC通過(guò)高度表達(dá)TNFSF4，刺激原始T細(xì)胞向Th2、Th17細(xì)胞的分化，發(fā)生免疫應(yīng)答，促進(jìn)氣道炎癥；而pDC高度表達(dá)IDO，刺激Treg細(xì)胞分化產(chǎn)生，調(diào)節(jié)肺部免疫耐受的形成[5]。

圖3 各組小鼠肺組織中膠原蛋白面積（Masson染色，400×）Fig.3 Collagen area of lung tissue in each group(Masson staining，400×)

表10 各組小鼠肺組織中 WAm、WAi比較（±s，μm2·μm-1）Tab.10 Comparison of WAm and WAi of lung tissue in each group(±s,μm2·μm-1)

表10 各組小鼠肺組織中 WAm、WAi比較（±s，μm2·μm-1）Tab.10 Comparison of WAm and WAi of lung tissue in each group(±s,μm2·μm-1)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：Compared with blank group，**P＜0.01；compared with model group，##P＜0.01

17.69±2.3 4 33.57±6.83**20.22±7.17##22.11±3 .98##組別 n WAm WAi空白組模型組地米組平喘方組10 10 10 1 0 29.60±10.57 75.23±28.98**35.23±12.3 6##48.02±2 2.45**##

TNFSF4又名 OX40配體（OX40 ligand，OX40L）、糖 蛋 白 34 （glycoprotein 34，gp34）、CD134 配 體（CD134 Ligand，CD134L），是腫瘤壞死因子超家族成員之一，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于活化的細(xì)胞，如成熟DC、活化B細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，與受體結(jié)合后，可以調(diào)節(jié)CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化及增殖，促使Th0細(xì)胞向Th2、Th17細(xì)胞分化，并且可以延長(zhǎng)免疫應(yīng)答效應(yīng)，抑制T細(xì)胞凋亡[6-7]。IDO是一種含鐵血紅素單體蛋白，可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為FOXP3+的Treg細(xì)胞，而且可以誘導(dǎo)致其快速活化，抑制IL-17的分泌[8-9]。Kumar等[10]認(rèn)為通過(guò)IDO誘導(dǎo)并擴(kuò)增Treg細(xì)胞是重建免疫耐受的經(jīng)典途徑。本研究相關(guān)性分析提示，TNFSF4可以正向調(diào)節(jié)RORγt，負(fù)向調(diào)節(jié)FOXP3，從而促使T細(xì)胞向Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分泌IL-17及IL-23，促進(jìn)氣道炎癥；而IDO負(fù)向調(diào)節(jié) RORγt，正向調(diào)節(jié)FOXP3，促使 T細(xì)胞向 Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)免疫耐受。

古人認(rèn)為痰飲為津液所化，與水同類(lèi)，具有很強(qiáng)的流動(dòng)性。若膈之“膠固之痰”隨氣而動(dòng)，當(dāng)痰氣交阻于肺，礙肺氣宣降，即發(fā)為哮喘。津血同源，二者之間相互資生、相互轉(zhuǎn)化，病理上相互影響、相互傳變，因此，痰和瘀易于互結(jié)。若痰瘀互結(jié)，可使痰飲難化，瘀血難除，固著于肺，致使哮喘反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈。因此課題組認(rèn)為痰氣交阻是哮喘發(fā)作的關(guān)鍵，痰瘀互結(jié)是哮喘難治的重點(diǎn)。平喘方是虞堅(jiān)爾教授立足于“伏痰夙瘀”的病機(jī)而創(chuàng)制的，由炙麻黃、苦杏仁、紫蘇子、大桃仁、萊菔子、淡子芩、炙甘草等組成。方中炙麻黃宣肺平喘，苦杏仁降氣平喘，兩者相配一宣一降；紫蘇子辛溫，可以溫散痰飲，使水上行；萊菔子長(zhǎng)于降氣祛痰定喘，與紫蘇子相伍，亦是一宣一降，四藥相合疏利痰氣，迅速恢復(fù)肺之氣機(jī)；大桃仁活血化瘀，撼哮喘之本，阻于痰瘀互結(jié)；黃芩佐制方中他藥之溫燥之性，使痰濕得化而不致傷及陰津。整方宣降通用，與肺之宣降功能同性相求，化痰與祛瘀同用，相輔相成。本研究發(fā)現(xiàn)，平喘方可以恢復(fù)pDC/cDC的平衡，促進(jìn)IDO表達(dá)，抑制TNFSF4表達(dá)，進(jìn)而促使T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，從而影響Treg/Th17細(xì)胞的分化平衡，誘導(dǎo)免疫耐受，降低氣道炎癥；同時(shí)平喘方可以使哮喘模型小鼠的膠原蛋白面積、WAm和WAi減少，從而改善氣道重建。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，麻黃中的主要成分麻黃堿有擬腎上腺素樣作用，可通過(guò)釋放遞質(zhì)發(fā)揮間接作用，也可以直接激動(dòng)α及β-腎上腺素能受體，松弛支氣管平滑肌，興奮心肌，升高血壓[11]?？嘈尤始按筇胰手泻锌嘈尤受?，其可明顯減少卵白蛋白致豚鼠哮喘模型的炎癥細(xì)胞數(shù)量，抑制舒縮性介質(zhì)和炎性因子水平的升高，從而能夠鎮(zhèn)咳平喘[12]。大桃仁還具有抗凝血、抗炎、抗過(guò)敏等作用[13]。紫蘇子的成分紫蘇油中的脂肪酸類(lèi)具有抗過(guò)敏、抗炎功效，且其機(jī)制與抑制血小板活化因子和白細(xì)胞三烯（leucotriene，LT）產(chǎn)生有關(guān)；同時(shí)還能夠抑制血小板聚集，防止血栓形成[14]。萊菔子中含有芥子堿，能夠通過(guò)擴(kuò)張氣道平滑肌增加肺和氣管容量[15]。黃芩的成分黃芩苷可以顯著抑制白細(xì)胞內(nèi)LTB4和LTC4的生物合成[16]，還能夠抑制血小板聚集，抑制凝血酶誘導(dǎo)的纖維蛋白產(chǎn)生[17]。

綜上所述，平喘方可以恢復(fù)pDC/cDC的平衡，誘導(dǎo)免疫耐受，降低氣道炎癥，同時(shí)還能改善氣道重建。從現(xiàn)代藥理看，該方中既有擴(kuò)張支氣管平滑肌的成分，又有抗過(guò)敏的成分，至于其作用于DC中的哪些具體靶點(diǎn)，作用機(jī)制如何，尚需進(jìn)一步研究。