丙戊酸誘導(dǎo)的SD大鼠和C57小鼠孤獨(dú)癥譜系障礙模型的比較

胡宇玲，鄭文霞，侯倩伶，汪小青，陳思思，徐夢(mèng)洲，茹思蘭江·安外爾，陳 笛

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶400016）

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，主要臨床特征為社交交流缺陷、興趣狹隘和重復(fù)刻板行為，部分伴有智力發(fā)育遲緩、感覺(jué)減退或超感覺(jué)等問(wèn)題［1-3］。我國(guó)孤獨(dú)癥譜系障礙患病率正逐年遞增，目前已高達(dá)1%［4］。目前，ASD 已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)之一，理想的孤獨(dú)癥譜系障礙動(dòng)物模型是探討其發(fā)病機(jī)制和探索有效的防治措施的重要手段。

目前認(rèn)為孤獨(dú)癥譜系障礙是環(huán)境與遺傳因素共同作用所致。流行病學(xué)研究表明，胎兒暴露于某些具有神經(jīng)毒性的藥物，如丙戊酸（valproic acid，VPA）［5］和丙酸［6］等抗癲癇藥物，可導(dǎo)致其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，嚴(yán)重影響認(rèn)知功能發(fā)展，導(dǎo)致ASD 的產(chǎn)生，因此，神經(jīng)毒理學(xué)方法是建立和研究ASD 動(dòng)物模型的重要手段之一。孕期VPA 暴露是一種經(jīng)典而常用的神經(jīng)毒理學(xué)ASD模型，孕12.5 d的大鼠或小鼠腹腔注射VPA后，其子代均可出現(xiàn)社交性和探索性行為減少、重復(fù)刻板運(yùn)動(dòng)、焦慮緊張狀態(tài)等孤獨(dú)癥譜系障礙樣表現(xiàn)［7-10］。

不同種屬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由于其遺傳背景、對(duì)藥物的敏感度和藥動(dòng)學(xué)特征不同，可能對(duì)相同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕a(chǎn)生不同程度的影響，但目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道比較大鼠和小鼠VPA 孤獨(dú)癥譜系障礙模型的差異。本研究分別以C57BL/6J（C57）小鼠和Sprague Dawley（SD）大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，淺析其VPA 誘導(dǎo)ASD模型的異同，以期為合理選擇動(dòng)物模型提供更為可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和儀器

育齡期C57小鼠和SD大鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（渝）2018-0003，分別飼養(yǎng)于該中心SPF級(jí)環(huán)境中。正常標(biāo)準(zhǔn)飲水進(jìn)食，恒定溫度23℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h/12 h日/夜交替光照。

VPA（批號(hào)：WXBC6802V，純度：98%，美國(guó)Sigma 公司）；75%乙醇（重慶川東化工有限公司）；平面翻正用觀察面板（20 cm×15 cm×2 cm）、聽(tīng)覺(jué)驚愕反射用金屬塊（1 cm3）、金屬板（35 cm×25 cm×0.5 cm）（自制）；三箱社交實(shí)驗(yàn)裝置（小鼠：120 cm×20 cm×22 cm；大鼠：120 cm×45 cm×40 cm）和曠場(chǎng)箱（小鼠：40 cm×40 cm×30 cm，大鼠：100 cm×100 cm×40 cm，箱底用黑色記號(hào)筆劃分成25 個(gè)等分小方格，其中靠近邊緣的16 個(gè)方格記為周?chē)礁瘢行牡? 個(gè)方格記為中央方格）（重慶昊然實(shí)業(yè)有限公司）；攝像頭（深圳市奧尼電子工業(yè)有限公司）；數(shù)碼相機(jī)（日本Sony公司）。

1.2 模型建立和分組

經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，分別將SD 大鼠和C57 小鼠的雄性和雌性按1∶2 的比例合籠過(guò)夜，于合籠后第2 天分籠時(shí)檢查雌鼠陰道，如有陰道栓存在則視為受精成功（即妊娠孕鼠），并記為孕1 d。將孕12.5 d的C57小鼠和SD大鼠分別隨機(jī)分為VPA組和正常對(duì)照組，分別一次性ip給予VPA 600 mg·kg-1或等劑量無(wú)菌生理鹽水。

1.3 孕鼠出產(chǎn)率和仔鼠外觀畸形率觀測(cè)

計(jì)數(shù)妊娠孕鼠數(shù)量和最終產(chǎn)仔的C57 小鼠和SD 大鼠孕鼠數(shù)量（即分娩孕鼠數(shù)）。孕鼠出產(chǎn)率（%）=分娩孕鼠數(shù)/妊娠孕鼠數(shù)×100%。

觀察出生當(dāng)天仔鼠（包括雄性和雌性仔鼠）的頭骨和四肢等外觀發(fā)育形態(tài)，統(tǒng)計(jì)仔鼠有無(wú)外觀畸形（即四肢發(fā)育短小、眼球和耳廓不明顯）情況。仔鼠外觀畸形率（%）=畸形仔鼠數(shù)/出生仔鼠總數(shù)×100%。

1.4 雄性仔鼠生理發(fā)育觀測(cè)

在出生第4天觀察和計(jì)數(shù)每組存活的雄性仔鼠數(shù)，4 d 存活率（%）=4 d 齡雄性活仔鼠數(shù)/出生時(shí)雄性活仔鼠數(shù)×100%。

分別于仔鼠出生后第5，10，15，20 和25 天，測(cè)量雄性仔鼠的體質(zhì)量和尾長(zhǎng)。于第45 天觀察成年后各組雄性仔鼠尾部畸形（即尾部彎折）情況，尾部外觀畸形率（%）=成年后尾部彎折雄性仔鼠數(shù)/成年后雄性仔鼠總數(shù)×100%。

觀測(cè)雄性仔鼠門(mén)齒萌出（incisor eruption）、睜眼（eye opening）和腹毛生長(zhǎng)（development of fur）達(dá)到陽(yáng)性的日齡。門(mén)齒萌出，以肉眼可見(jiàn)仔鼠上齒雙側(cè)出現(xiàn)白點(diǎn)，以手觸碰后有刺痛感為陽(yáng)性；睜眼，以仔鼠雙眼睜開(kāi)程度≥眼眶的1/2 為陽(yáng)性；腹毛生長(zhǎng)，以腹部從粉紅色變?yōu)橛忻粫r(shí)的白色（SD 大鼠）或黑色（C57小鼠）為陽(yáng)性。

1.5 雄性仔鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育水平觀測(cè)

觀測(cè)雄性仔鼠的平面翻正反射（surfacing righting reflex）、斷崖回避反射（cliff avoidance reflex）、空中翻正反射（air righting reflex）、轉(zhuǎn)體（pivoting）行為達(dá)到陽(yáng)性的天數(shù)等神經(jīng)反射發(fā)育指標(biāo)。①平面翻正反射：將仔鼠置于仰臥位，連續(xù)3 次均在2 s內(nèi)翻轉(zhuǎn)至四肢著地位為陽(yáng)性。②斷崖回避反射：仔鼠在30 cm高平臺(tái)邊緣露出頸部，在10 s內(nèi)轉(zhuǎn)身或退回為陽(yáng)性。③空中翻正反射：仔鼠仰面從30 cm高平臺(tái)落下，連續(xù)3 次均四足著地為陽(yáng)性。④轉(zhuǎn)體：仔鼠在3 min 內(nèi)原地順時(shí)針或逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)且不前進(jìn)或后退為陽(yáng)性。

觀測(cè)雄性仔鼠抓桿（bar holding test）和爬行（crawl）行為達(dá)到陽(yáng)性的天數(shù)，反映其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和肌張力。抓桿：將仔鼠前肢搭在高約25 cm橫桿上，能握住或挎住橫桿懸掛≥2 s為陽(yáng)性；爬行：仔鼠能自主用四肢向前直線爬行3 cm為陽(yáng)性。

觀測(cè)雄性仔鼠的聽(tīng)覺(jué)驚愕反射（auditory startle reflex）陽(yáng)性天數(shù)，在仔鼠平行方向放置一金屬板，用上方距板15 cm處的金屬塊垂直撞擊下方金屬板，若仔鼠聽(tīng)到聲響后出現(xiàn)蜷縮或震顫為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.6 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test）檢測(cè)雄性仔鼠自發(fā)探索性活動(dòng)和焦慮情緒

出生后第28天，將受試雄性仔鼠先置于曠場(chǎng)箱內(nèi)自由活動(dòng)10 min 以適應(yīng)箱體環(huán)境，記錄接下來(lái)10 min內(nèi)受試鼠在箱體內(nèi)的總跨格數(shù)、中央格跨越數(shù)、垂直得分（直立和攀墻累積次數(shù)）和排便次數(shù)情況。

1.7 三箱社交實(shí)驗(yàn)（three chamber sociability test）檢測(cè)雄性仔鼠社交能力和興趣偏好

出生后第30天進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將受試雄性仔鼠置裝置中適應(yīng)10 min。實(shí)驗(yàn)分2 個(gè)階段：①社交測(cè)試。在一側(cè)腔室線圈內(nèi)放入一只同齡雄性不同窩的陌生鼠（鼠1），另一側(cè)腔室內(nèi)放入一空線圈，觀察10 min 內(nèi)受試鼠的活動(dòng)情況。②社交偏好測(cè)試。在階段（1）結(jié)束后，在空線圈內(nèi)放入另一只同齡雄性不同窩的陌生鼠（鼠2），繼續(xù)觀察10 min。由攝像系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)軟件記錄受試鼠在2個(gè)階段分別在每個(gè)側(cè)室中停留的時(shí)間及與鼠1和鼠2嗅觸交流的時(shí)間。

1.8 自我捋毛實(shí)驗(yàn)（self-grooming test）檢測(cè)雄性仔鼠重復(fù)刻板行為

出生后第32天，先將受試鼠放入曠場(chǎng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境10 min，而后開(kāi)始計(jì)時(shí)10 min，觀察受試鼠用爪或嘴梳理面部、四肢、周身和尾部的累積時(shí)間。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均用x±s 表示，采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，生理發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和行為學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則用采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合時(shí)用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；孕鼠出產(chǎn)率、新生雄性仔鼠外觀畸形率和仔鼠4 d 存活率的統(tǒng)計(jì)采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖繪制采用GraphPad Prism5.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 孕中期注射VPA 對(duì)C57 小鼠和SD 大鼠孕產(chǎn)率和外觀畸形率的影響

C57 小鼠正常對(duì)照組和VPA 組孕鼠出產(chǎn)率分別為85.7%（6/7）和52.4%（10/21），組間具有顯著性差異（P＜0.05）；SD 大鼠正常對(duì)照組和VPA 組孕鼠出產(chǎn)率為分別為100%（5/5）和91.7%（11/12），組間無(wú)差異。

C57 小鼠正常對(duì)照組全部新生仔鼠均膚色紅潤(rùn)、體形完好，VPA組部分仔鼠四肢發(fā)育短小，眼球和耳廓不明顯，外觀畸形率22.4%（11/49），較正常對(duì)照組〔0%（0/35）〕顯著增加（P＜0.01）；SD大鼠正常對(duì)照組（32只）和VPA組（45只）新生仔鼠外觀畸形率均為0%。

2.2 孕中期注射VPA 對(duì)C57 小鼠和SD 大鼠雄性仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

雄性仔鼠4 日存活率，C57 小鼠VPA 組為58.6%（17/29），較正常對(duì)照組85.7%（12/14）顯著下降（P＜0.05）；SD 大鼠正常對(duì)照組和VPA 組分別為85.7%（12/14）和84.2%（16/19），組間無(wú)顯著差異。

C57大鼠和SD小鼠雄性仔鼠的體質(zhì)量均隨日齡增長(zhǎng)而增加。在出生后第5，10 和15 天，二者VPA組體質(zhì)量與各自正常對(duì)照組無(wú)明顯差異；出生后第20和25天，二者VPA組體質(zhì)量均顯著低于自正正常對(duì)照組（小鼠P＜0.05，圖1A；大鼠P＜0.01，圖1B）。

嚙齒動(dòng)物的短尾畸形被認(rèn)為與輕微的神經(jīng)管缺陷有關(guān)。雄性仔鼠尾長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果顯示，C57 小鼠VPA組尾長(zhǎng)與其正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異（圖1C），而SD 大鼠VPA 組與正常對(duì)照組相比，第5～25 天均有顯著減少（P＜0.01，圖1D）。

Fig.1 Effect of valproic acid（VPA）on body mass and tail length of male offspring of C57 mice（A，C）and SD rats（B，D）. Pregnant C57 mice and SD rats were ip injected with VPA 600 mg·kg-1（VPA group）or saline（normal control group）on embryonic day 12.5 of gestation. ±s.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

正常對(duì)照組小鼠和大鼠的雄性仔鼠尾部形態(tài)正常，而VPA 組雄性仔鼠可見(jiàn)尾部彎曲畸形，VPA組小鼠尾部外觀畸形率為11.8%（2/17），與其正常對(duì)照組0%（0/12）無(wú)明顯差異；而VPA 組大鼠尾部外觀畸形率為87.5%（14/16）較其正常對(duì)照組0%（0/12）顯著性升高（P＜0.01）。

雄性仔鼠門(mén)齒萌出和睜眼達(dá)到陽(yáng)性的天數(shù)，C57 小鼠VPA 組較其正常對(duì)照組明顯滯后（P＜0.05，P＜0.01），SD 大鼠VPA 組與其正常對(duì)照組間無(wú)顯著性差異；而雄性仔鼠腹毛生長(zhǎng)，大、小鼠VPA組與各自正常對(duì)照組均無(wú)明顯差異（圖2）。提示孕期注射VPA 可使雄性子代C57 小鼠生理發(fā)育明顯遲緩，但SD大鼠并未表現(xiàn)出此現(xiàn)象。

Fig.2 Effect of VPA on incisor eruption，eye opening and development of fur in male offspring of C57 mice（A）and SD rats（B）. See Fig.2 for the mouse and rat treatment.x±s.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 孕中期注射VPA 對(duì)C57 小鼠和SD 大鼠雄性仔鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響

神經(jīng)反射功能檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3），與其正常對(duì)照組相比，C57小鼠VPA組轉(zhuǎn)體行為達(dá)到陽(yáng)性的時(shí)間較晚（P＜0.05），而平面翻正、斷崖回避和空中翻正行為達(dá)到陽(yáng)性的時(shí)間無(wú)顯著差異；SD 大鼠VPA 組與其正常對(duì)照組相比，除轉(zhuǎn)體行為外，平面翻正（P＜0.01）、斷崖回避（P＜0.01）和空中翻正（P＜0.05）行為達(dá)到陽(yáng)性的時(shí)間均明顯延遲。提示孕中期注射VPA的SD大鼠雄性子代神經(jīng)反射功能發(fā)育遲緩現(xiàn)象較C57小鼠更為明顯。

與正常對(duì)照組相比，VPA組C57小鼠直線爬行行為達(dá)陽(yáng)性的時(shí)間無(wú)顯著差異，但抓桿行為達(dá)陽(yáng)性時(shí)間明顯延遲（P＜0.05），提示胚胎期VPA 暴露對(duì)C57 小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能無(wú)明顯影響，但可導(dǎo)致其肌張力降低。與正常對(duì)照組相比，VPA 組SD 大鼠直線爬行（P＜0.01）和抓桿行為達(dá)陽(yáng)性的時(shí)間均顯著延遲（P＜0.01），提示胚胎期VPA 暴露不僅導(dǎo)致SD大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力受損，同時(shí)肌張力也受到影響。

與各自的正常對(duì)照組相比，SD 大鼠和C57 小鼠VPA 組的聽(tīng)覺(jué)驚愕反射達(dá)陽(yáng)性的時(shí)間均明顯提前（P＜0.01），提示胚胎期VPA 暴露在SD 大鼠和C57小鼠均可能導(dǎo)致雄性仔鼠聽(tīng)覺(jué)過(guò)敏（圖3）。

Fig.3 Effect of VPA on development of nervous reflex，motor coordination and muscular tension，and sensory reflex in male offspring of C57 mice（A）and SD rats（B）. See Fig.2 for the mouse and rat treatment. x±s. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 孕中期注射VPA 對(duì)C57 小鼠和SD 大鼠雄性仔鼠的空間探索力和焦慮情緒的影響

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與各自正常對(duì)照組相比，VPA組C57 小鼠和SD 大鼠在跨格總數(shù)上均無(wú)明顯差異，表明VPA暴露不影響其運(yùn)動(dòng)功能。VPA組C57小鼠垂直得分低于正常對(duì)照組（P＜0.05），中央格跨越數(shù)無(wú)明顯差異。而VPA組SD大鼠中央格跨越數(shù)和垂直得分均低于正常對(duì)照組（P＜0.01），表明孕期VPA暴露可導(dǎo)致SD大鼠雄性仔鼠對(duì)陌生環(huán)境的探索興趣下降。VPA組SD大鼠和C57小鼠的排便次數(shù)與各自正常對(duì)照組均無(wú)明顯差異，提示其焦慮程度相當(dāng)（表1）。

2.5 孕中期注射VPA 對(duì)C57 小鼠和SD 大鼠雄性仔鼠社交能力和興趣偏好的影響

在三箱社交實(shí)驗(yàn)的第一階段（表2），與正常對(duì)照組相比，VPA 組SD 大鼠在有鼠1 的箱體中停留的時(shí)間和與鼠1 的嗅觸時(shí)間明顯減少（P＜0.01），與物體嗅觸時(shí)間也明顯減少（P＜0.05），在中間格停留的時(shí)間與正常對(duì)照組無(wú)差異，但在物體箱體停留的時(shí)間明顯增加（P＜0.01），表現(xiàn)出不愿與陌生鼠進(jìn)行交流，而更傾向于待在無(wú)陌生鼠的空間里，提示其社交能力下降。與正常對(duì)照組相比，VPA組C57小鼠在有鼠1 的箱體和有物體的箱體中停留的時(shí)間、與鼠1和物體嗅觸時(shí)間以及在中間格停留的時(shí)間均無(wú)顯著差異，未表現(xiàn)出明顯的社交異常。在實(shí)驗(yàn)的第二階段（表2），VPA組SD大鼠與其正常對(duì)照組相比，在有鼠1 的箱體和中間格停留的時(shí)間明顯增加（P＜0.01），在有鼠2的箱體停留的時(shí)間、與鼠1和與鼠2嗅觸的時(shí)間均顯著減少（P＜0.01）；VPA 組C57小鼠與其正常對(duì)照組小鼠相比，在有鼠1 的箱體中停留的時(shí)間和與鼠2嗅觸時(shí)間明顯增加（P＜0.01），在有鼠2的箱體停留的時(shí)間和與鼠2嗅觸時(shí)間顯著減少（P＜0.05），但在中間格停留時(shí)間無(wú)明顯差異。結(jié)果顯示，SD大鼠和C57小鼠的VPA組雄性仔鼠均未表現(xiàn)出對(duì)新鮮事物的偏好，存在興趣狹隘的特征。

Tab.1 Effect of VPA on exploration，locomotory and anxiety levels in male offspring in open field test

Tab.2 Effect of VPA on social behavior of phaseⅠand phaseⅡin three-chamber test in male offspring

2.6 孕中期注射VPA 對(duì)C57 小鼠和SD 大鼠雄性仔鼠重復(fù)刻板行為的影響

VPA組SD大鼠雄性仔鼠自我捋毛時(shí)間明顯長(zhǎng)于其正常對(duì)照組（P＜0.05），而C57 小鼠兩組間自我捋毛時(shí)間無(wú)顯著差異（表3）。提示VPA 組SD 大鼠具有明顯的刻板重復(fù)性動(dòng)作。

Tab.3 Effect of VPA on self-grooming time in male

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已建立了多種ASD 動(dòng)物模型。大量的研究表明，嚙齒類(lèi)動(dòng)物在孕期暴露VPA，其仔鼠可出現(xiàn)社交障礙、興趣狹隘、焦慮以及刻板重復(fù)性行為等ASD 的典型癥狀［11-12］，因此，該模型已成為國(guó)際公認(rèn)的最接近人類(lèi)ASD 的神經(jīng)毒理學(xué)模型［13-14］。關(guān)于大、小鼠的VPA 誘導(dǎo)的ASD模型均有報(bào)道，但大鼠和小鼠生理結(jié)構(gòu)、生化代謝和藥物代謝動(dòng)力存在差異，這些特征可能導(dǎo)致同一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诓煌蠓N中表觀效度、結(jié)構(gòu)效度和構(gòu)建成功率等出現(xiàn)較大差異，因此，本研究在SD大鼠和C57小鼠孕12.5 d時(shí)腹腔注射VPA，觀察孕鼠的孕產(chǎn)情況、仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)，以期為合理選擇ASD動(dòng)物模型提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

為比較VPA誘導(dǎo)的SD大鼠和C57小鼠ASD模型表觀效度的差異，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)觀察2 種動(dòng)物是否能復(fù)制ASD 的典型癥狀。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，兩者的VPA組均表現(xiàn)出對(duì)陌生環(huán)境的探索興趣明顯降低，符合ASD 患者興趣狹隘的特征；但大鼠跨越中央格得分明顯降低，表現(xiàn)出活動(dòng)模式局限，而C57小鼠VPA組雄性仔鼠未見(jiàn)這一改變。三箱社交實(shí)驗(yàn)不僅是一種廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估嚙齒動(dòng)物社交能力的手段，也可用于檢測(cè)對(duì)新鮮事物的偏好［15］，本研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠VPA組雄性仔鼠表現(xiàn)出明顯的社交缺陷，但C57小鼠VPA組雄仔鼠的社交狀態(tài)與正常組無(wú)異，這與Kim 等［16］的報(bào)道相異，他們?cè)诮oC57孕鼠注射同樣劑量VPA后觀察到了仔鼠社交異?，F(xiàn)象，但VPA暴露的時(shí)間窗與本實(shí)驗(yàn)不同；本研究還發(fā)現(xiàn)，SD大鼠和C57小鼠VPA組雄性仔鼠均缺失了嚙齒類(lèi)動(dòng)物偏好新鮮事物的特征，這與ASD 患者普遍存在興趣狹隘情況相似［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，VPA組雄性大鼠出現(xiàn)明顯的刻板重復(fù)性行為，印證了患有ASD的青少年重復(fù)行為會(huì)加重的理論［18］，但在VPA 組C57 小鼠VPA 組雄性仔鼠未能發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的改變。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，孕中期VPA暴露，可導(dǎo)致大鼠和小鼠的仔鼠均出現(xiàn)某些典型的ASD核心癥狀，但大鼠表現(xiàn)出的癥狀種類(lèi)更多，程度更重，因此，SD大鼠VPA模型與ASD患者的核心癥狀更為吻合，優(yōu)于C57小鼠VPA模型。

ASD是一類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，腦的發(fā)育可影響社會(huì)認(rèn)知、行為方式的發(fā)展，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)VPA組雄性大、小鼠模型是否存在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷差異進(jìn)行了檢測(cè)。平面翻正、斷崖回避、空中翻正和轉(zhuǎn)體常被視作前庭功能發(fā)育的標(biāo)志。本研究中SD大鼠VPA組雄性仔鼠除轉(zhuǎn)體實(shí)驗(yàn)外上述各項(xiàng)指標(biāo)的陽(yáng)性天數(shù)均遲于正常組，而C57小鼠VPA組則是僅在轉(zhuǎn)體實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的滯后。此外，模VPA組動(dòng)物還可復(fù)制ASD患者的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)門(mén)控受損［13］、聽(tīng)覺(jué)過(guò)敏［19］等癥狀：大、小鼠VPA組的肌張力均較其對(duì)照組明顯減弱，并伴隨聽(tīng)覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象，但在動(dòng)作協(xié)調(diào)功能方面僅有明顯受損現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育方面，SD大鼠VPA組較C57小鼠VPA組表現(xiàn)出更多方面的發(fā)育異常。

在生理發(fā)育方面，已有文獻(xiàn)報(bào)道在ASD的早期發(fā)育篩查中體質(zhì)量異常具有重要意義［20］，本研究在SD大鼠和C57小鼠VPA組均觀察到體質(zhì)量輕于正常對(duì)照組。尾部短小和彎曲畸形是一種發(fā)生在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中輕微的神經(jīng)管缺陷［21］，本研究也發(fā)現(xiàn)SD 大鼠VPA 組雄性仔鼠的彎尾畸形非常明顯，小鼠雖也有類(lèi)似情況，但差異不明顯。睜眼陽(yáng)性天數(shù)可用來(lái)反映視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育及拓?fù)浞瓷浒l(fā)育的標(biāo)志［22］，Roullet 等［23］報(bào)道了VPA 小鼠具有睜眼延遲現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，C57小鼠VPA組雄性仔鼠睜眼達(dá)到陽(yáng)性天數(shù)明顯推遲，而SD 大鼠VPA 組雄性仔鼠無(wú)此類(lèi)現(xiàn)象。門(mén)齒萌出時(shí)間也僅有C57 小鼠VPA 組較對(duì)照組明顯延遲。由此可見(jiàn)，C57 小鼠VPA 組一般生理發(fā)育的遲緩現(xiàn)象較SD 大鼠VPA組更嚴(yán)重。

理想的動(dòng)物模型，除了要盡可能再現(xiàn)人類(lèi)疾病，具有良好的表觀效度、預(yù)測(cè)效度和結(jié)構(gòu)效度以外，還必須考慮可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性。本研究在觀察大、小鼠孕產(chǎn)情況中發(fā)現(xiàn)VPA對(duì)C57小鼠孕鼠具有較強(qiáng)的生殖毒性和遺傳毒性，孕小鼠流產(chǎn)率顯著增加，出產(chǎn)率和仔鼠4 d 存活率亦明顯低下。VPA組大量C57孕鼠流產(chǎn)和仔鼠死亡，一方面需增加實(shí)驗(yàn)用鼠以達(dá)到樣本數(shù)量，以至繁育周期長(zhǎng)，模型建立效率低；另一方面，也造成飼料、器材和低值易耗品的浪費(fèi)，使得實(shí)驗(yàn)成本增高［24］。此外，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南（GB/T 35892-2018）》，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循替代、減少和優(yōu)化的3R 原則，盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦和使用數(shù)量［25］。因此，從建模效率、實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的角度考慮，使用SD 大鼠制備VPA 誘導(dǎo)的ASD模型優(yōu)于C57小鼠。

綜上所述，SD 大鼠和C57 小鼠的VPA 模型雖均可復(fù)制ASD 的典型癥狀，但大鼠VPA 組表現(xiàn)出更多的ASD核心癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，程度也更為嚴(yán)重，具有更好的表觀效度。而且，從成本、建模效率和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)考慮，大鼠亦優(yōu)于小鼠。不過(guò)，小鼠與人類(lèi)的功能基因的同源性高達(dá)≥90%，廣泛用于人類(lèi)基因組學(xué)研究，且在VPA模型中一般生長(zhǎng)發(fā)育情況和對(duì)藥物敏感性上也優(yōu)于大鼠，因此可根據(jù)研究目的不同選擇適宜的模型。