氯喹對(duì)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

蒲 倩＊，吳成林＊，陳秀秀，3，王欲曉，周麗君，3

（1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510000；2.中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，北京100048；3.安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，安徽合肥230032）

三陰乳腺癌是一種雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2 表達(dá)均為陰性的乳腺癌亞型，約占乳腺癌的10%～20%，具有侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展快和預(yù)后差等臨床特點(diǎn)，且內(nèi)分泌治療和靶向治療一般無(wú)效［1］?；熀头暖熓悄壳叭幦橄侔┑某Ｒ?guī)治療手段，但經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后其預(yù)后依然很差，無(wú)復(fù)發(fā)生存和總生存率較低［2］。因而迫切需要針對(duì)三陰乳腺癌開(kāi)發(fā)新的治療藥物，改進(jìn)治療策略。

氯喹（chloroquine）是一個(gè)經(jīng)典的抗瘧疾藥物，在腫瘤的治療過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有效抑制包括黑色素瘤、淋巴瘤和膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖［3-5］，對(duì)非腫瘤性上皮細(xì)胞基本不產(chǎn)生毒性作用［6］。同時(shí)有報(bào)道，氯喹可增加膽囊癌、宮頸癌和肝癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶、喜樹(shù)堿和肝動(dòng)脈插管化療栓塞等的敏感性［7-9］，以及增強(qiáng)乳腺癌對(duì)放療的敏感性［10］。已有研究表明，氯喹可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制小鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是與刺激免疫系統(tǒng)有關(guān)［11］。目前尚無(wú)有關(guān)氯喹對(duì)人三陰乳腺癌細(xì)胞具體作用機(jī)制的研究報(bào)道。本研究觀察氯喹對(duì)人三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，并探究其作用機(jī)制，以期為三陰乳腺癌的臨床治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 藥物、細(xì)胞、主要試劑和儀器

氯喹購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。人三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自中科邁晨公司；胎牛血清購(gòu)自墨西哥MP Biomedicals 公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；二甲亞砜購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)美天旎公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自西班牙Cytognos 公司；甲紫（結(jié)晶紫）購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司；兔抗人自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3B）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase-2，CDK2）、CDK4、胱天蛋白酶3（caspase 3）、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）、活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase 3）、活化的PARP 及小鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D3（Cyclin D3）單抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗人自噬底物SQSTM1 單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；小鼠抗人β 肌動(dòng)蛋白單抗購(gòu)自美國(guó)proteintech 公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG抗體（二抗）購(gòu)自北京華興博創(chuàng)生物技術(shù)中心。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Bio-Rad imark全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；OLYMPUS CK2 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將MDA-MB-231細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以每孔5×103細(xì)胞（100 μL懸液）接種于96孔板中，37℃，5%CO2下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，分別加氯喹1.25，2.5，5，10，20，40，80和160 μmol·L-1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照孔，每組設(shè)4 復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 和48 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加100 μL 稀釋的CCK-8溶液（無(wú)血清DMEM∶CCK-8原液=9∶1），繼續(xù)培養(yǎng)3 h后取出，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度（A450nm）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A450nm-空白對(duì)照組A450nm）×100%。選擇存活率在20%～80%之間的氯喹濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231 細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后，以每孔500細(xì)胞密度接種于6孔板中，每孔體積為2 mL，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，加氯喹終濃度為0，20，40和80 μmol·L-1培養(yǎng)3 d；然后換液繼續(xù)培養(yǎng)5 d 后取出，移除培養(yǎng)液并用預(yù)冷1×PBS 小心清洗2 次，加4%多聚甲醛固定20 min。去除固定液后加甲紫室溫染色30 min。棄染色液，用流水緩慢清洗干凈，置空氣中干燥，拍照。用image J 計(jì)數(shù)克隆數(shù)，＞50 個(gè)細(xì)胞為1 個(gè)克隆。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，按每孔1×105細(xì)胞接種于6 孔板中。第2天待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，加氯喹終濃度為0，20，40 和80 μmol·L-1進(jìn)行處理，每組設(shè)3 復(fù)孔。作用24 h后消化收集細(xì)胞，800×g離心5 min，棄上清，用1×PBS洗滌2次后，加預(yù)冷70%乙醇500 μL，輕吹混勻，4℃固定過(guò)夜。次日800×g 離心5 min，吸去乙醇，加1×PBS 1 mL重懸細(xì)胞，用200目尼龍膜過(guò)濾細(xì)胞懸液；800×g 離心5 min，棄上清，加碘化丙啶500 μL 混勻，避光染色15 min 后于流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞處理同1.5，分別作用24和48 h后消化收集細(xì)胞，800×g離心5 min，棄上清。加1×結(jié)合緩沖液1 mL，800×g離心5 min，棄上清。加1×結(jié)合緩沖液100 μL 重懸細(xì)胞，重懸液中加Annexin V-FITC 10 μL 混勻，避光孵育15 min。然后加1×結(jié)合緩沖液1 mL清洗1次，棄上清，加1×結(jié)合緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，最后加碘化丙啶5 μL后，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.7 Western 印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)

氯喹0，20，40和80 μmol·L-1分別處理細(xì)胞24和48 h 后，用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，12 000×g 離心10 min，取上清液，以4∶1 體積比加5×上樣緩沖液混合，煮沸5 min。提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加小鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D3單抗（1∶1000）、兔抗人CDK2單抗（1∶1000）、兔抗人CDK4 單抗（1∶1000）、兔抗人胱天蛋白酶3單抗（1∶1000）、兔抗人PARP 單抗（1∶1000）、兔抗人活化胱天蛋白酶3 單抗（1∶1000）、兔抗人活化PARP 單 抗（1∶1000）、兔 抗 人LC3B 單 抗（1∶1000）、小鼠抗人SQSTM1單抗（1∶2000）或小鼠抗人β肌動(dòng)蛋白單抗（1∶20000）4℃孵育過(guò)夜。TBS-T清洗3 次，每次5 min。隨后加HRP 標(biāo)記羊抗小鼠或羊抗兔IgG 二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，TBS-T清洗3次后發(fā)光，顯影，掃描后分析蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA），待測(cè)蛋白表達(dá)水平用待測(cè)蛋白IA與β肌動(dòng)蛋白IA比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯喹對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，氯喹5～160 μmol·L-1分別作用24和48 h后，均能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖（P＜0.01），半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為56.15和28.82 μmol·L-1，表明氯喹對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖具有抑制作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取氯喹20，40 和80 μmol·L-1處理MDA-MB-231細(xì)胞。

Fig.1 Effect of chloroquine（CQ）on viability of MDAMB-231 cells by CCK-8 assay. The cells were treated with CQ 1.25，2.5，5，10，20，40，80 and 160 μmol·L-1 for 24 and 48 h，respectively.，n=4.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 氯喹對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成的影響

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，氯喹用藥3組細(xì)胞克隆明顯減少（P＜0.01）；且隨著氯喹濃度的增加，細(xì)胞克隆形成逐漸減少（P＜0.01）。由此表明，氯喹可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成能力。

2.3 氯喹對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖3）所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，氯喹20 和40 μmol·L-1處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，G0/G1期百分比顯著升高（P＜0.01），G2/M期比百分比顯著降低（P＜0.01）。氯喹80 μmol·L-1處理細(xì)胞24 h后，G0/G1期百分比下降（P＜0.01），G2/M期百分比升高（P＜0.01）。由此提示，較低濃度氯喹處理24 h 后，MDA-MB-231 細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，較高濃度阻滯在G2/M期。

2.4 氯喹對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖4）所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，氯喹20和40 μmol·L-1處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化，80 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；處理48 h后，3組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。由此表明，氯喹促進(jìn)MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡，并具有濃度依賴性（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of chloroquine on colony formation capacity of MDA-MB-231 cells. The cells were treated with CQ 20，40 and 80 μmol·L-1 for 3 d. B was the result of count analysis of A. ，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group；##P＜0.01，compared with CQ 20 μmol·L-1 group；△△P＜0.01，compared with CQ 40 μmol·L-1 group.

Fig.3 Effect of chloroquine on cell cycle of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry. The cells were treated with CQ 20，40 and 80 μmol·L-1 for 24 h. B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

Fig.4 Effect of chloroquine on apoptosis of MDA-MB-231 cells detected by flow cytometry. The cells were treated with CQ 20，40 and 80 μmol·L-1 for 24（A1）and 48 h（A2），respectively. B was the quantitative result of A.n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L- 1）group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with CQ 20 μmol·L-1 group；△△P＜0.01，compared with CQ 40 μmol·L-1 group.

2.5 氯喹對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期相關(guān)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，與細(xì)胞對(duì)照組相比，氯喹處理MDA-MB-231 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞周期蛋白D3，CDK4和CDK2蛋白表達(dá)水平隨氯喹濃度增加逐漸降低（圖5A 和5C，P＜0.01）；氯喹處理MDA-MB-231 細(xì)胞48 h 后，胱天蛋白酶3 和PARP 表達(dá)水平降低；活化的胱天蛋白酶3 和活化PARP表達(dá)水平隨氯喹濃度的增加逐漸升高（圖5B和5D，P＜0.01）。

2.6 氯喹對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的影響

Fig.5 Effect of chloroquine on expression of cell cycle and apoptosis-related proteins of MDA-MB-231 cells detected by Western blotting. A：the expression of cyclin D3，cyclin-dependent kinase 2（CDK2）and CDK4 in the cells treated with CQ 20，40 and 80 μmol·L-1 for 24 h；B：the expression of caspase 3，cleaved caspase 3，poly-ADP-ribose polymerase（PARP）and cleaved PARP in the cells treated with CQ 20，40 and 80 μmol·L-1 for 48 h；C：the quantitative result of A；D：the quantitative result of B.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group；##P＜0.01，compared with CQ 20 μmol·L-1 group；△△P＜0.01，compared with CQ 40 μmol·L-1 group.

Western 印跡檢測(cè)結(jié)果（圖6）所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，氯喹3 組處理MDA-MB-231 細(xì)胞48 h后，自噬標(biāo)志蛋白LC3B和SQSTM1表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），表明氯喹可有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞自噬溶酶體內(nèi)蛋白降解，導(dǎo)致LC3B和SQSTM1聚集，提示氯喹抑制MDA-MB-231細(xì)胞自噬。

Fig.6 Effect of chloroquine on expression of autophagyrelated markers in MDA-MB-231 cells detected by Western blotting. See Fig.5B for the cell treatment. B was the quantitative result of A. LC3B：microtubule-associated protein1 light chain 3B.，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group；##P＜0.01，compared with CQ 20 μmol·L-1 group；△△P＜0.01，compared with CQ 40 μmol·L-1 group.

3 討論

自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解內(nèi)源性底物的重要過(guò)程，常在營(yíng)養(yǎng)缺乏、低氧應(yīng)激和藥物誘導(dǎo)時(shí)發(fā)生，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激的重要反應(yīng)［12］。一般認(rèn)為，正常細(xì)胞可以通過(guò)自噬的自凈作用維持穩(wěn)態(tài)，防止癌變的發(fā)生。近年來(lái)也有大量研究表明，高水平的自噬可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，突變的腫瘤細(xì)胞能在惡劣條件下利用自噬提供的能源和材料維持生存［13］。另外，自噬也與腫瘤細(xì)胞耐藥性的形成有關(guān)［14］，如Zhu 等［15］報(bào)道，抑制自噬顯著增加塞來(lái)昔布（celecoxib）對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC3 的凋亡，提示自噬對(duì)PC3細(xì)胞是一種保護(hù)性作用。氯喹是一種常用的自噬抑制劑，它通過(guò)抑制自噬體與溶酶體的融合進(jìn)而影響自噬包裹物的降解［16］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氯喹對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用［17］，如Fan 等［18］報(bào)道，氯喹在低濃度（0.25～32 μmol·L-1）時(shí)即可抑制肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)，在高濃度（64～128 μmol·L-1）則誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡；Hu等［19］也報(bào)道，氯喹可觸發(fā)肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞G0/G1期阻滯，誘導(dǎo)DNA損傷及細(xì)胞凋亡，作用呈濃度和時(shí)間依賴性。同時(shí)，氯喹可作為傳統(tǒng)化療藥物如奧沙利鉑和順鉑的增敏劑［20-21］，提高靶向藥物如索拉非尼［［22］及放療［23］的抗癌效果。

自噬涉及眾多的自噬相關(guān)蛋白的參與，其中LC3B是目前最明確貫穿整個(gè)自噬過(guò)程并能出現(xiàn)在晚期自噬溶酶體中的自噬相關(guān)蛋白，參與了自噬體膜的形成［24］；SQSTM1是最為廣泛的自噬降低底物之一，可連接LC3 和泛素化的底物，在自噬溶酶體中被降解［25］；這2 個(gè)蛋白常被用來(lái)作為自噬水平變化的指征。Beclin1 是自噬起始的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控分子［26］，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231 細(xì)胞中通過(guò)CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）技術(shù)完全敲除自噬相關(guān)基因Beclin1 可誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯并抑制細(xì)胞增殖［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，氯喹作用三陰乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞后，自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3B 和自噬底物SQSTM1聚集增多，表明自噬溶酶體內(nèi)蛋白降解過(guò)程被阻斷，細(xì)胞自噬和細(xì)胞增殖被抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程被阻滯，細(xì)胞凋亡增加，提示自噬在維持三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期進(jìn)程和存活、促進(jìn)細(xì)胞增殖中發(fā)揮巨大作用，是“保護(hù)性自噬”。

腫瘤細(xì)胞的異常增殖通常與細(xì)胞周期和凋亡的變化有關(guān)。細(xì)胞周期是一個(gè)高度有序的運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程，在不同時(shí)相的多個(gè)調(diào)控點(diǎn)上受到調(diào)節(jié)。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞中周期檢查點(diǎn)反應(yīng)缺陷，導(dǎo)致其異常增殖［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細(xì)胞中，氯喹20 和40 μmol·L-1處理24 h 能將細(xì)胞阻滯在G0/G1期；且氯喹80 μmol·L-1處理短時(shí)間（6，12和18 h）細(xì)胞也被阻滯在G0/G1期（數(shù)據(jù)略）；氯喹80 μmol·L-1處理24 h后，細(xì)胞被阻滯在G2/M期，同時(shí)細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證氯喹對(duì)MDAMB-231細(xì)胞周期的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用Western印跡法檢測(cè)氯喹處理后細(xì)胞中的周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，細(xì)胞周期蛋白D3、CDK4 和CDK2 呈現(xiàn)不同程度的下降。正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白D 可與CDK4/6 結(jié)合，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期通過(guò)調(diào)控點(diǎn)，是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要靶點(diǎn)。然而腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D 過(guò)度表達(dá)，使細(xì)胞G1期縮短，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞G1期調(diào)控異常，從而引起腫瘤細(xì)胞的異常增殖［29］。Jia 等［30］已在相關(guān)研究中證實(shí)，口腔鱗癌細(xì)胞SCC25 和CAL27 中細(xì)胞周期蛋白D1 的過(guò)表達(dá)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、臨床分期及患者的總生存率減少密切相關(guān)。Patel等［31］發(fā)現(xiàn)，抑制CDK4 和CDK2 能影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和耐藥，提高臨床用藥效果。因此，本研究結(jié)果提示，氯喹可通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白D3、CDK4和CDK2的表達(dá)，在低濃度（20和40 μmol·L-1）時(shí)可將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，高濃度（80 μmol·L-1）時(shí)阻滯細(xì)胞在G2/M期，具體機(jī)制有待深入研究。

凋亡在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)正常發(fā)育中起重要作用，凋亡過(guò)程的紊亂與多種疾病相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞通常是抗凋亡的，正常的清除監(jiān)視被破壞［32］。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同濃度氯喹處理MDA-MB-231 細(xì)胞48 h 后，凋亡率逐漸遞增，表明氯喹能誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡。胱天蛋白酶3是細(xì)胞凋亡的終末剪切酶，是凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白。在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)時(shí)，胱天蛋白酶3 會(huì)被剪切成活化胱天蛋白酶3 形式，活化胱天蛋白酶3 將底物PARP剪切成2 個(gè)片段，細(xì)胞質(zhì)活化胱天蛋白酶3 和活化PARP 顯著增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，氯喹處理后，MDA-MB-231細(xì)胞中胱天蛋白酶3和凋亡底物PARP 減少，而活化胱天蛋白酶3 和活化PARP 的表達(dá)升高，提示氯喹可以激活胱天蛋白酶依賴性的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，氯喹可通過(guò)抑制細(xì)胞自噬、阻滯周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞凋亡以抑制三陰乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞增殖，其作用可能與其調(diào)控細(xì)胞周期蛋白和激活胱天蛋白酶依賴性的細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究初步探索了氯喹作用三陰乳腺癌細(xì)胞的分子機(jī)制，為三陰乳腺癌的治療提供新思路。