紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素的提取與純化及抗氧化活性初探

黃志偉，董子鈺，范曉越，霍湘蕓，蔣耀瑛，王歲樓

（中國(guó)藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京 211198）

紅葉石楠是一種美麗的植物，葉子發(fā)芽后先紅后綠，一般作為行道樹(shù)養(yǎng)殖。在之前對(duì)紅葉石楠功能性色素的研究基礎(chǔ)上[1-3]，結(jié)合對(duì)香蕉皮中類(lèi)胡蘿卜素的研究[4-6]，并進(jìn)行紅葉石楠中類(lèi)胡蘿卜素提取與純化方法的研究，旨在為紅葉石楠綜合利用及其功能性色素開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：紅葉石楠葉，2018年4月采于中國(guó)藥科大學(xué)江寧校區(qū)；無(wú)水乙醇、丙酮、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、鹽酸等，均為分析純?cè)噭?/p>

儀器與設(shè)備：DFY-500型高速中藥粉碎機(jī)、DZF-6050型真空干燥箱、TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、KH-100B型超聲儀、RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、離心機(jī)、全溫振蕩培養(yǎng)箱。

1.2 紅葉石楠預(yù)處理

石楠葉清洗，瀝干水分，放入烘箱干燥24 h，取出后真空干燥2 h。研磨過(guò)篩（100目），得紅葉石楠粉末試樣。

1.3 類(lèi)胡蘿卜素提取

稱(chēng)取試樣2 g，按一定料液比加入提取劑，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間。以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心提取5 min，取上清液即為類(lèi)胡蘿卜素粗提液。

1.4 類(lèi)胡蘿卜素含量測(cè)定

于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定粗提液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算類(lèi)胡蘿卜素含量。

Y=0.073 6X+0.002 7.

式中：Y——吸光度；

X——提取量，μg/g。

1.5 單因素提取試驗(yàn)

提取溶劑選擇：稱(chēng)取2 g紅葉石楠粉末，分別加入石油醚、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、丙酮∶石油醚 （3∶7， 4∶6， 5∶5， 6∶4， 7∶3） 作為提取劑，在料液比1∶30（g∶mL），溫度40℃條件下超聲提取40 min。

提取料液比選擇：取4組樣品，每組稱(chēng)取2 g紅葉石楠粉末。以丙酮作為提取劑，在40℃下，分別以料液比 1∶10，1∶15， 1∶20，1∶30（g∶mL）超聲提取40 min。

提取時(shí)間選擇：取5組樣品，每組稱(chēng)取2 g紅葉石楠粉末。以丙酮作為提取劑，以料液比1∶20（g∶mL） 在40℃條件下超聲提取20，30，40，50，60 min。

提取溫度選擇：取5組樣品，每組稱(chēng)取2 g紅葉石楠粉末。以丙酮作為提取劑，分別在30，40，50℃下超聲提取40 min。

提取率計(jì)算：

1.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件

采用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定最優(yōu)提取方案。

紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.7 純化試驗(yàn)方法

硅藻土活化，與洗脫劑進(jìn)行濕法裝柱，加入類(lèi)胡蘿卜素粗提液，用丙酮沖洗至液體無(wú)色，后用乙醇以一定的流速解析，得到純化后的紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素溶液，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算純化后溶液中類(lèi)胡蘿卜素的含量。

（1） 洗脫劑選擇。以硅膠作吸附劑，上樣量2 mL。分別用丙酮、丙酮/石油醚 （7∶3，6∶4，3∶7） 及石油醚，以1 mL/min流速洗脫，測(cè)定流出液的吸光度。

（2） 吸附劑選擇。以丙酮∶石油醚7∶3作為洗脫劑，上樣量1 mL，分別用硅膠、硅膠/硅藻土（1∶1，1∶3，3∶1） 及硅藻土作為吸附劑，以1 mL/min流速洗脫，測(cè)定流出液的吸光度。

（3） 上柱量選擇。以丙酮/石油醚7∶3作為洗脫劑，硅膠/硅藻土1∶1作為吸附劑，分別加入0.5，1.0，1.5，2.0 mL的類(lèi)胡蘿卜素粗提取液，以流速1 mL/min的流速洗脫，測(cè)定流出液的吸光度。

純化倍數(shù)計(jì)算：

1.8 類(lèi)胡蘿卜素抗氧化活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[4]的方法，利用水楊酸法測(cè)定羥自由基清除率，評(píng)價(jià)紅葉石楠提取液抗氧化活性。

式中A0——空白對(duì)照溶液吸光度；

AX——樣品溶液吸光度；

AX0——不含過(guò)氧化氫的空白對(duì)照溶液吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試驗(yàn)結(jié)果

溶劑對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖1，料液比對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖2，提取時(shí)間對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖3，提取溫度對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響見(jiàn)圖4。

圖1 溶劑對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響

圖2 料液比對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響

圖4 提取溫度對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取效果的影響

由圖1～圖4可知，不同的提取溶劑、料液比、提取溫度和提取時(shí)間都對(duì)提取效果有明顯的影響，最優(yōu)提取條件初步可以確定為：以丙酮作提取劑，最佳料液比1∶15，最優(yōu)提取溫度30℃，最優(yōu)提取時(shí)間50 min。

石楠葉類(lèi)胡蘿卜素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 石楠葉類(lèi)胡蘿卜素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)極差分析可知，各因素影響次序?yàn)榱弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取劑＞提取溫度；最優(yōu)理論提取方案正好與正交試驗(yàn)中提取量最大的第9號(hào)試驗(yàn)條件組合一致為A3B3C2D1。因此，該試驗(yàn)最優(yōu)提取條件確定為提取溶劑為丙酮，提取時(shí)間60 min，提取溫度40℃，料液比1∶20（g∶mL），此時(shí)類(lèi)胡蘿卜素提取量為529.43 μg/g。

2.2 純化試驗(yàn)結(jié)果

洗脫劑對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素純化效果的影響見(jiàn)圖5，吸附劑對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素純化效果的影響見(jiàn)圖6，上柱量對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素純化效果的影響見(jiàn)圖7。

由圖5～圖7可知，最佳洗脫劑為丙酮∶石油醚7∶3，最佳吸附劑為硅膠∶硅藻土為1∶1，最佳上樣量為1.5 mL。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，按上述條件純化后類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度47.94μg/mL（純化前類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量濃度26.47μg/mL），所以純化倍數(shù)=47.94/26.47=1.81。

2.3 類(lèi)胡蘿卜素抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

圖5 洗脫劑對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素純化效果的影響

圖6 吸附劑對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素純化效果的影響

圖7 上柱量對(duì)紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素純化效果的影響

紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取液及抗壞血酸清除率對(duì)比見(jiàn)圖8。

圖8 紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素提取液及抗壞血酸清除率對(duì)比

由圖8可知，當(dāng)羥自由基清除率相同的情況下，所需要的紅葉石楠提取液質(zhì)量濃度低于抗壞血酸濃度，如果提高提取液的質(zhì)量濃度，清除率也會(huì)大大提高，由此可知紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素抗氧化能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

從石楠葉提取類(lèi)胡蘿卜素的最佳條件為提取溶劑為丙酮，提取時(shí)間60 min，提取溫度40℃，料液比1∶20（g∶mL），提取率達(dá)0.052 9%。在室溫下，以丙酮∶石油醚（7∶3） 為洗脫劑，硅膠∶硅藻土（1∶1） 為吸附劑，上樣量為1.5 mL，粗提物可以初步純化，純化倍數(shù)為1.81。

紅葉石楠類(lèi)胡蘿卜素具有較好的羥基自由基清除能力，作為天然食品抗氧化劑有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。