25種中草藥提取物對棉花黃萎病菌的抑制作用

金利容 尹海辰 萬鵬 黃薇 許冬 楊妮娜

摘要以棉花黃萎病菌Verticillium dahliae為供試菌種，采用菌絲生長速率法測定了25種中草藥乙醇提取物的抑茵作用。結(jié)果表明，25種中草藥乙醇提取物中，花椒、黃柏和木香的抑菌作用最好，抑制率分別為59.30%、48.29%和45.54%。同時，這3種中草藥的乙醇提取物抑菌活性均顯著高于石油醚提取物的抑茵活性。在室內(nèi)毒力測定中，花椒、黃柏和木香的乙醇提取物對供試菌株的EG50分別為3.74，13.98和17.02mg/mL。

關(guān)鍵詞中草藥提取物;棉花;棉花黃萎病菌;抑制作用

中圖分類號：S435.621.2文獻標(biāo)識碼：B DOI：10.16688/j.zwbh.2018153

棉花是重要的經(jīng)濟作物，棉花黃萎病是棉花上的主要病害，嚴(yán)重影響棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量。棉花黃萎病是一種土傳病害，其病原菌具有廣泛的寄主，可產(chǎn)生具有強抗逆性的微菌核休眠結(jié)構(gòu)，能夠定殖在植物的根部和維管束內(nèi)，這些特點導(dǎo)致傳統(tǒng)的殺菌劑對其并不能產(chǎn)生好的防治效果。抗病品種的選育是防治棉花黃萎病的重要方法，但是，品種抗性的不穩(wěn)定是抗病育種的一大阻力。因此，黃萎病的防治一直是作物病害防治和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一大難題。

利用植物產(chǎn)生的活性物質(zhì)防治病害是植物病害防治的一個重要方面。植物是天然活性化合物的重要來源，具有非常豐富的次生代謝物質(zhì)。目前科研工作者已經(jīng)從植物中提取到多類抗真菌的活性物質(zhì)。與微生物殺菌劑相比，植物殺菌劑具有穩(wěn)定，不太容易受到環(huán)境要素影響，對人畜安全，低毒低污染等優(yōu)勢。在我國，中草藥在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有悠久的歷史。中草藥資源豐富，種類達1萬多種，是植物源殺菌劑的重要來源。

采用中草藥提取物抑制各種常見植物病害的研究已有一些文獻報道，比如玉米大斑病、番茄枯萎病、辣椒根腐病、黃瓜白粉病等，但未見中草藥提取物抑制棉花黃萎病菌的研究報道。筆者采用菌絲生長速率法測定了25種中草藥的乙醇提取物對棉花黃萎病菌的抑菌作用，在此基礎(chǔ)上選取抑菌活性最好的3種中草藥的乙醇提取物進行了毒力測定，并比較了這3種中草藥的乙醇提取物和石油醚提取物的抑菌活性。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供試菌種

棉花黃萎病菌V991b為一株典型的大麗輪枝菌Verticillium dahliae菌株，由本實驗室-80℃保存。

1.1.2供試中草藥

25種供試中草藥原料從湖北省武漢市中藥材市場采購，具體信息見表1。

1.2方法

1.2.1供試中草藥粗提取物的制備

粗提物的提取采用有機溶劑（乙醇和石油醚）提取法。將風(fēng)干的中藥用粉碎機磨制成干粉，稱取100g粉末分別置于250mL無水乙醇（或石油醚）中室溫浸泡15d后用布氏漏斗過濾。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃左右水浴蒸干溶劑，獲得粗提物，并保存于4C冰箱中備用。

1.2.2供試中草藥乙醇提取物的抑菌作用

采用生長速率法測定中草藥乙醇提取物對棉花黃萎病菌生長的抑制作用。將供試中草藥提取物稱重，先用200uL無水乙醇將其完全溶解，再加入無菌水使溶液的終濃度為10mg/mL，與冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基以體積比1：9的比例混勻后倒人培養(yǎng)皿中直至凝固，每處理3次重復(fù)，以無菌水和PDA培養(yǎng)基按同樣比例混勻作為對照?；罨闢991b，用6mm的打孔器沿著菌種同一個圓周打孔，用接種針小心將供試菌種接到含藥培養(yǎng)基的正中央，菌絲面朝下，每皿一塊。于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計算抑菌率。

抑菌率一（對照菌落直徑一處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.2.3

供試中草藥乙醇提取物的室內(nèi)毒力測定

根據(jù)“1.2.2”的結(jié)果，選擇抑菌率在45%以上的中草藥，設(shè)置2.5、5、10、20和40mg/mL 5個濃度梯度，按照“1.2.2”的試驗方法，測定不同濃度的中草藥乙醇提取物的抑菌作用，計算抑菌率。

1.2.4供試中草藥乙醇提取物和石油醚提取物的抑制作用比較

按照“1.2.2”中所述的試驗方法，統(tǒng)一將提取物配制成10mg/mL，分別測定抑菌效果好的3種供試中草藥的乙醇提取物和石油醚提取物的抑菌率，比較兩者的抑制活性。

1.2.5數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel軟件和SPSS軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)，將各中草藥乙醇提取物的抑菌率轉(zhuǎn)換成幾率值（y），藥劑濃度轉(zhuǎn)換成對數(shù)值（x），采用回歸法求得不同提取物對供試菌株的毒力回歸方程y=ax+b，并計算毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)r和抑制中濃度EG50。

2結(jié)果與分析

2.1供試中草藥乙醇提取物對棉花黃萎病菌的抑制作用

各中草藥乙醇提取物對棉花黃萎病菌的抑制作用結(jié)果見表2。由表2可知，25種中草藥乙醇提取物（測試濃度為10mg/mL）對棉花黃萎病菌均有不同程度的抑制作用。抑制作用最好的是花椒乙醇提取物，抑菌率為59.30%;抑菌率在45%以上的還有黃柏和木香的乙醇提取物。抑菌率在30%～45%的有蛇床子和苦參。選擇花椒、黃柏和木香進行后續(xù)試驗。

2.2供試中草藥乙醇提取物的室內(nèi)毒力測定

花椒、黃柏和木香的乙醇提取物對棉花黃萎病菌的抑制活性最好，抑制率均在45%以上。對這3種中藥的乙醇提取物進行了室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明，當(dāng)這3種中草藥的乙醇提取物的濃度在2.5～40mg/mL范圍內(nèi)時，隨著提取物濃度的增加，3種中草藥的乙醇提取物對黃萎病菌的抑菌能力有所增強（表3）。

對表3中的數(shù)據(jù)進行分析表明，提取物的濃度和抑制率之問存在明顯的線性關(guān)系，花椒、黃柏和木香的乙醇提取物對供試菌株的EC5。分別為3.74mg/mL、13.98mg/mL和17.02mg/mL。相關(guān)系數(shù)分別為0.94、0.96和0.98。結(jié)果見表4。

2.3供試中草藥乙醇提取物和石油醚提取物的抑制作用比較

測定和比較花椒、黃柏和木香的乙醇提取物和石油醚提取物對黃萎病菌的抑制作用，結(jié)果表明，3種中草藥的乙醇提取物的抑菌活性都顯著高于石油醚提取物的抑菌活性（P<0.05）。在這3種中草藥的乙醇提取物中，花椒的抑菌作用最好。但在石油醚提取物中，木香的抑菌作用最好，結(jié)果見表5。

3討論

引起棉花黃萎病的病原菌為大麗輪枝菌。該研究以大麗輪枝菌V991b為供試菌株，選取25種中草藥提取物對大麗輪枝菌V991b進行室內(nèi)抑菌試驗。結(jié)果表明，25種中草藥提取物對大麗輪枝菌均有一定的抑制作用，其中花椒、黃柏和木香的乙醇提取物（藥劑濃度為10mg/mL）的抑菌率均在45%以上，且抑菌活性隨著藥劑濃度的升高而增強?；ń返囊掖继崛∥镆志Ч詈?，抑菌率在50%以上?；ń纺軌虍a(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，可能在抑制病原菌生長過程中發(fā)揮一定的作用。馬欣等報道黃柏的乙醇提取物對番茄枯萎病菌和辣椒根腐病菌的抑菌率能夠達到90%和60%以上。黃柏能夠產(chǎn)生黃酮醇甙，對某些人類病原菌如金黃色葡萄球菌等具有抑制作用，但該物質(zhì)在抑制植物病原菌的過程中是否有作用，需要進一步驗證。本研究還比較了3種中草藥的乙醇提取物和石油醚提取物的抑菌活性，結(jié)果表明乙醇提取物的抑菌作用要顯著高于石油醚提取物的抑菌作用，其原因尚不明確。

很多研究表明一些中草藥對植物病原菌有一定的抑菌作用，抑菌機理主要是中草藥的有效成分通過破壞病原菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁或者干擾病原菌的代謝作用達到抑菌的目的。下一步的研究工作包括：對花椒、黃柏和木香等的有效抑菌活性成分的分離和鑒定;活性成分對大麗輪枝菌抑菌機制研究;田問藥效測定等。篩選對植物病原菌有效的中草藥藥劑并研究其作用機制，將會為植物源農(nóng)藥的研制和開發(fā)提供新途徑和新思路。