黑曲霉超臨界萃取物抑制鏈格孢作用機制的初步研究

張素 袁洪威 李祝 肖洋 吉玉玉 唐婧紅

摘要本試驗對黑曲霉菌絲體超臨界萃取物（SE）抑制鏈格孢的機制進行了初步研究。采用超臨界萃取從黑曲霉菌絲體中獲得樣品SE，使用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）對其萃取物進行分離鑒定，并通過細胞膜滲透性測定、核酸和總蛋白含量測定、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染色法、活性氧（ROS）含量測定、呼吸代謝途徑等方法對SE的抑菌機制進行研究;電導率及核酸、蛋白結(jié)果顯示，SE能影響鏈格孢細胞膜的完整性，SE處理茵體4.5h，電導率比陰性對照增加了37.2%，胞外核酸蛋白含量顯著增加。DAPI染色結(jié)果顯示，DAPI可以和鏈格孢內(nèi)的核酸結(jié)合，經(jīng)SE作用30min，SE可引起細胞核染色質(zhì)異常彌散。ROS試驗結(jié)果顯示，SE可以激發(fā)菌體產(chǎn)生過多的活性氧，SE作用鏈格孢40min時ROS含量比陰性對照增加了79.67%。呼吸代謝試驗結(jié)果顯示，SE能抑制三羧酸循環(huán)（TCA）中的琥珀酸脫氫酶的活性，其抑制率為35.4%。SE具有較強的抑菌活性，其抑菌機制是通過影響細胞膜的正常功能、損傷細胞結(jié)構(gòu)和抑制真菌的呼吸代謝等方面實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞黑曲霉;超臨界萃取;鏈格孢;抑菌機制;琥珀酸脫氫酶;DAPI

中圖分類號：S482.292文獻標識碼：A DoI：10.16688/j.zwbh.2018193

2.3SE對菌體細胞膜的影響

培養(yǎng)液電導率的改變可以反映細胞膜滲透性的改變。本研究的測定結(jié)果顯示，SE作用菌體初期，上清液電導率隨時問的增加而增大。當作用4.5h時，SE組電導率達到峰值，比陰性對照增加了37.2%（P<0.05）（圖3），說明SE能影響鏈格孢細胞膜的通透性。有文獻報道可測定加藥前后DNA和RNA等大分子物質(zhì)的變化推測藥物對細胞膜完整性的影響。為考慮SE影響鏈格孢細胞膜的通透性程度，測定了SE作用后菌體大分子物質(zhì)泄漏情況。如圖4所示，SE作用菌體初期核酸和蛋白質(zhì)含量明顯高于陰性對照組，雖然隨時問推移呈逐漸下降趨勢，但差異依舊顯著（P<0.05）。以上兩個試驗說明，SE不僅引起鏈格孢細胞膜滲透性的改變，還可導致核酸和蛋白等大分子物質(zhì)外漏。

2.4SE對鏈格孢核酸含量的影響

DAPI是一種能夠與DNA和RNA結(jié)合的熒光染料，核酸量越大，熒光亮度越強。通過倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX73）觀察，DAPI可以穿透細胞膜進入細胞內(nèi)部，與核酸相結(jié)合。陰性對照與SE處理鏈格孢30min內(nèi)的熒光顯微鏡觀察結(jié)果見圖5。與陰性對照相比SE處理鏈格孢后該細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)異常彌散，推測可能是SE導致的急性細胞核破碎，隨時問推移，細胞核損傷程度逐漸降低。

2.5SE對鏈格孢活性氧含量的影響

胞內(nèi)ROS過度積累，會對膜脂、蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生氧化損傷，進而觸發(fā)或者加速細胞凋亡進程。Image J熒光定量分析結(jié)果（圖6）顯示：SE可以激發(fā)鏈格孢菌體產(chǎn)生過多的活性氧，SE組胞質(zhì)中ROS含量呈先升后降趨勢，在處理40min時出現(xiàn)峰值，與陰性對照相比差異極顯著（P<0.01）。SE處理會導致鏈格孢菌體內(nèi)大量的ROS產(chǎn)生，從而影響細胞的正常代謝過程。

2.6SE對菌體三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶的影響

琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）是真核細胞和原核細胞進行TCA循環(huán)途徑中的關(guān)鍵酶，在細胞能量代謝中起著重要的作用，其活性變化可反映細胞的能量代謝狀況。圖7a為采用Bradford法制作的標準曲線，回歸方程y=1.3771x+0.1356，相關(guān)系數(shù)R²=0.9956，具有良好線性關(guān)系，滿足樣品測試要求。SE對鏈格孢的SDH酶具有明顯的抑制作用。SE組SDH比活性與陰性對照相比降低了35.4%。SE組MDH比活性與陰性對照相比雖呈下降趨勢，但未有顯著差異（P>0.05）;由上可知，SE處理后會導致正常的三羧酸循環(huán)過程受阻，影響細胞的正常代謝。

3討論

近年來隨著綠色化學的興起，研究者們已經(jīng)從生物中發(fā)現(xiàn)大量有活性的天然產(chǎn)物，很大程度地豐富了化學資源。真菌化學成分種類豐富，包括甾醇、萜、生物堿、氨基酸、肽類、多糖等，已成為探索和發(fā)掘新化合物的重要領(lǐng)域。超臨界萃取是一種高效的提取技術(shù)，目前已廣泛應用于天然產(chǎn)物的分離提取過程。本文通過超臨界萃取從黑曲霉菌絲體中提取得到萃取物SE。經(jīng)GC-MS分析出5種已知化合物，含量最高的兩種物質(zhì)為5-羥甲基糠醛（90.194%）和5，5-（氧二亞甲基）-雙-2-呋喃甲醛（7.843%）。有文獻報道5一羥甲基糠醛具有一定的醫(yī)藥價值，糠醛可用于農(nóng)藥合成，因此推測黑曲霉超臨界萃取物SE可能具有生物活性，本文對SE的抑菌機制進行了研究。

研究結(jié)果顯示，SE對鏈格孢具有明顯的抑菌活性。通過對培養(yǎng)液、胞外核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的測定結(jié)果表明，SE不僅引起鏈格孢細胞膜滲透性的改變，還破壞了細胞膜的完整性，導致胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的泄漏。其作用效果與劉海燕等用細辛揮發(fā)油處理土生鏈格孢后結(jié)果相一致，SE處理導致鏈格孢的細胞膜完整性受到破壞。DAPI是一種能夠與DNA和RNA結(jié)合的熒光染料，核酸含量越高，熒光亮度也就越強。AL-LENE253研究表明糠醛能導致核染色質(zhì)異常，造成細胞核損傷。DAPI染色結(jié)果顯示經(jīng)SE作用后鏈格孢與陰性對照相比細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)異常彌散，推測可能是SE導致急性的細胞核破碎化，而且隨時問推移，細胞核損傷程度降低。活性氧（reactive OX-ygen species，ROS）是一類分子氧部分還原的分子或離子，具有很強的氧化活性，過量的ROS能夠使生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂類發(fā)生過氧化鏈式反應，造成細胞結(jié)構(gòu)的損傷，影響生理活性。SE可以激發(fā)菌體中產(chǎn)生過多的活性氧，SE作用鏈格孢40min時ROS含量比陰性對照增加了79.67%，試驗結(jié)果與ALLEN等所描述糠醛導致胞內(nèi)活性氧積累，從而損傷細胞結(jié)構(gòu)一致。呼吸代謝是生物體進行生命活動的重要表現(xiàn)形式，其實質(zhì)是細胞內(nèi)糖的氧化代謝過程，一旦糖的氧化代謝被抑制，供給細胞生命活動所需的能量和合成代謝所需要的碳架及還原力就無法生成，使生物體的生長和繁殖受阻。琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，對細胞生長代謝和繁殖是必需的。本研究結(jié)果顯示，SE對鏈格孢SDH的活性具有明顯的抑制作用，SE作用鏈格孢SDH酶的比活性比陰性對照降低了35.4%，這與SE會抑制參與TCA循環(huán)和糖酵解的相關(guān)酶活論證相一致。推測其原因可能是SE與SDH相結(jié)合，導致酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使酶的活性降低，從而導致菌體ATP和NADH的合成受阻，最終抑制其呼吸代謝系統(tǒng)。

綜上所述，SE通過影響細胞膜的正常功能、損傷細胞結(jié)構(gòu)和抑制真菌的呼吸代謝等方面抑制鏈格孢的生長，其抑菌活性可能與萃取物中的活性物質(zhì)相關(guān)。本試驗中得到的萃取物是多種化學成分的混合物，抑菌活性是一種主要成分的作用，還是多種化學成分協(xié)同作用，它們的反應機制等問題目前還未知，要解決這些問題還有待于進一步的科學研究。本文通過試驗明確了黑曲霉超臨界萃取物主要成分的含量，并對其抑制鏈格孢的機制進行了初探，為黑曲霉真菌資源和微生物農(nóng)藥的進一步開發(fā)應用提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。