甾醇載體蛋白2抑制劑的研究進(jìn)展

陶濤 杜馨

摘要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的持續(xù)增加，嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人類(lèi)生存。高效、安全的新型農(nóng)藥的創(chuàng)制是有效控制害蟲(chóng)的重要保證。膽固醇是昆蟲(chóng)細(xì)胞膜和脂蛋白的重要組成成分，是類(lèi)固醇激素的合成前體。但昆蟲(chóng)本身缺乏合成膽固醇的關(guān)鍵酶，無(wú)法從頭合成膽固醇，需要從植物中攝取。甾醇載體蛋白2（SCP-2）在昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。SCP-2可以作為篩選高效安全新農(nóng)藥的潛在靶標(biāo)。本文就近幾年篩選出的甾醇載體蛋白2抑制劑進(jìn)行了總結(jié)。

關(guān)鍵詞甾醇載體蛋白2;害蟲(chóng)防治;新農(nóng)藥創(chuàng)制;篩選方法;抑制劑

中圖分類(lèi)號(hào)：S48文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2018210

膽固醇作為類(lèi)固醇激素的合成前體，同時(shí)作為細(xì)胞膜和脂蛋白的重要組成成分，在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、變態(tài)發(fā)育以及繁殖過(guò)程中起著重要作用。昆蟲(chóng)體內(nèi)缺少?gòu)念^合成膽固醇所需的羊毛甾醇合酶和鯊烯單氧化酶，而哺乳動(dòng)物可以通過(guò)甲羥戊酸途徑從頭合成膽固醇。已知的參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)有很多種，其中甾醇載體蛋白2（SCP-2）蛋白作為重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)類(lèi)固醇激素的合成具有重要作用。阻斷昆蟲(chóng)體內(nèi)膽固醇的獲取途徑是研發(fā)新型殺蟲(chóng)劑的有效方向。

1甾醇載體蛋白2（SCP-2）

SCP-2，一種非特異性的固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一類(lèi)相對(duì)分子量較小的膽固醇、磷脂、脂肪酸、脂酰CoA等胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。1980年，Noland等首次從小鼠肝臟中提取出SCP-2蛋白，發(fā)現(xiàn)其能夠激活膽固醇水解酶，以此來(lái)改變細(xì)胞膜內(nèi)外膽固醇的濃度，而且在體外培養(yǎng)組織系統(tǒng)中，SCP-2能夠影響膽固醇的運(yùn)輸。

SCP-2在脊椎動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物、微生物、軟體動(dòng)物中均有分布。黑腹果蠅Drosophila melano-gaster、埃及伊蚊Aedes aegypti、棉貪夜蛾Spodopteralittoralis、家蠶Bombyx mori、斜紋夜蛾Spodoptera li-tufa、煙草天蛾Manduca sexta、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera等昆蟲(chóng)的SCP-2基因都已經(jīng)被克隆。對(duì)SCP-2的亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，部分上述昆蟲(chóng)的SCP-2主要存在于中腸細(xì)胞中。SCP-2與膽固醇結(jié)合的體外研究發(fā)現(xiàn)，SCP-2在膽固醇攝取、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、酯化和氧化中起作用。SCP-2具有典型的外部親水內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)，由4～5個(gè)a螺旋和β折疊圍繞組成一個(gè)疏水腔，膽固醇、脂肪酸、植物甾醇等多種脂質(zhì)可以與其結(jié)合。SCP-2可以通過(guò)C端a螺旋的結(jié)構(gòu)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)的結(jié)合和釋放，且與不同底物具有不同的結(jié)合方式。

甾醇載體蛋白抑制劑主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方式抑制載體蛋白與脂質(zhì)的結(jié)合。迄今為止，甾醇載體蛋白抑制劑的知識(shí)大部分集中在蚊子研究中。與埃及伊蚊SCP-2（AeSCP-2）類(lèi)似，脊椎動(dòng)物SCP-2蛋白結(jié)合膽固醇和脂肪酸。同樣地，AeSCP-2和脊椎動(dòng)物SCP-2的過(guò)表達(dá)都增加了細(xì)胞中膽固醇的量。雖然SCP-2抑制劑可以抑制SCP-2與膽固醇、脂肪酸、植物甾醇等的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，但脊椎動(dòng)物SCP-2活性的降低并不影響小鼠的正常生命活動(dòng)，故埃及伊蚊SCP-2抑制劑（AeSC-PIs）在正常脊椎動(dòng)物細(xì)胞中幾乎沒(méi)有毒性，可以推斷其在人體中無(wú)毒或毒性較低。將昆蟲(chóng)體內(nèi)甾醇載體蛋白2作為靶標(biāo)，阻斷植物甾醇獲取途徑，是開(kāi)發(fā)新殺蟲(chóng)劑的有效方法。

2篩選抑制劑的方法

目前抑制劑篩選的方法主要分為實(shí)物篩選和虛擬篩選。實(shí)物篩選是通過(guò)帶熒光標(biāo)記的膽固醇和待篩抑制劑同時(shí)與SCP-2進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)對(duì)熒光物質(zhì)的濃度變化進(jìn)行檢測(cè)，即可測(cè)得抑制劑的抑制效果。常用的有NBD膽固醇和免疫膠體金。

虛擬篩選的方法分為四種：（1）隨機(jī)合成篩選法;（2）類(lèi)同合成法;（3）天然活性物模擬法;（4）生物合理設(shè)計(jì)法。其中生物合理設(shè)計(jì)法是利用靶標(biāo)在生物體內(nèi)的關(guān)鍵生理生化作用，篩選設(shè)計(jì)合成影響靶標(biāo)的化合物，再對(duì)其中潛在藥物前體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行不斷優(yōu)化來(lái)開(kāi)發(fā)新農(nóng)藥。該方法具有針對(duì)性強(qiáng)、效率高的特點(diǎn)，在實(shí)際研究中被大量使用。隨著生物信息學(xué)和高通量篩選技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行藥物篩選提供了一種更高效、安全、經(jīng)濟(jì)的方法。與實(shí)物篩選需要相應(yīng)的儀器設(shè)備和試驗(yàn)時(shí)問(wèn)長(zhǎng)不同，虛擬篩選耗時(shí)短但需要大型的電腦或處理器來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在目前篩選抑制劑時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)條件的不同可以選擇不同的篩選方法。

3已篩選出的SCP-2抑制劑

3.1埃及伊蚊SCP-2抑制劑

Lan Que課題組將純化后的埃及伊蚊SCP-2（AeSCP-2），利用帶有NBD熒光標(biāo)記的膽固醇（簡(jiǎn)稱(chēng)NBD膽固醇）與膽固醇的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用進(jìn)行高通量篩選，由于膽固醇的環(huán)狀戊烷基團(tuán)將其親水的羥基包圍，膽固醇呈疏水性，故SCP抑制劑（SCPI）的共同特征是它們相對(duì)疏水，分子量較小且接近于膽固醇。篩選出5種具有SCPI活性的化合物，測(cè)量得其對(duì)AeSCP-2的結(jié)合親和力SCPI-5>SC-PI-2>SCPI-4>SCPI-3>SCPI-1，并測(cè)定了每種化合物對(duì)SCP-2的半數(shù)抑制濃度（IG50）（見(jiàn)表1）。生物活性測(cè)定表明，SCPI對(duì)埃及伊蚊具有很高的致死率，對(duì)耐Bt蛋白的埃及伊蚊也有一定致死作用，其中SCP>I對(duì)多種蚊子和一些鱗翅目昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)都有致死效應(yīng)（表1）。

Thiyagesan等根據(jù)AeSCP-2的三維結(jié)構(gòu)從Argus Lab小分子庫(kù)中篩選出133種植物化學(xué)分子，再使用對(duì)接軟件Autodock進(jìn)行對(duì)接試驗(yàn)，篩選出了2種結(jié)合能最低（panthenol，triterpenoid），且穩(wěn)定的有效抑制劑（表1）。Senthilraja和Kan-dasamy根據(jù)AeSCP-2的三維結(jié)構(gòu)，利用Argusdock在13種紅樹(shù)林衍生物中篩選出了2種結(jié)合能最低且與活性位點(diǎn)結(jié)合較好的抑制劑。這2種抑制劑對(duì)環(huán)境污染較小，成本低，且對(duì)蚊子幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)有一定的抑制作用（表1）。

在植物源SCP-2抑制劑的研究中，α-倒捻子素是一種不溶于水但溶于戊烷、甲苯、石油醚等低極性有機(jī)溶劑的植物源物質(zhì)，其作為埃及伊蚊SCP-2抑制劑，對(duì)多種蚊子的幼蟲(chóng)都具有致死效應(yīng)，半數(shù)致死劑量分別達(dá)到4.8、52、14.1、14.9、38.7unol/L（表1）。

姜黃素是提取自姜科或天南星科中的一些植物根莖中的一種化學(xué)成分，其本質(zhì)為二酮類(lèi)化合物，具有明顯的疏水性。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)姜黃素及其類(lèi)似物對(duì)AeSCP-2活性有抑制作用，同時(shí)對(duì)幼蟲(chóng)有一定的致死效果?？s氧硫脲類(lèi)藥物對(duì)AeSCP-2的親和力也較高，具有較好的殺蟲(chóng)活性（表1）。

3.2斜紋夜蛾SCP-2抑制劑

在鱗翅目斜紋夜蛾的研究中，通過(guò)虛擬篩選得到了4種斜紋夜蛾SCP-2（S1SCP-2）抑制劑，具有對(duì)S1SCP-2的高親和力，且在生物活性測(cè)定中發(fā)現(xiàn)對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)具有抑制作用（表1）。

3.3棉鈴蟲(chóng)SCP-2抑制劑

通過(guò)高通量虛擬篩選從218780種化合物中篩選出9種具有棉鈴蟲(chóng)SCP-2抑制劑活性的化合物（H1、H7、H14、H19、H24、H28、H29、H37和H43），這些抑制劑在分子的一端或兩端都有苯環(huán)或鹵代苯環(huán)等疏水基團(tuán)。在對(duì)這些抑制劑進(jìn)行初步生物活性測(cè)定后選擇其中5種（H1、H14、H7、H29和H19）進(jìn)行深入測(cè)定，發(fā)現(xiàn)5種抑制劑在不同濃度下對(duì)幼蟲(chóng)的最高致死率分別達(dá)到50%、54%、17%、33%和48%（濃度分別為625、125、625、25umol/L和25umol/L。經(jīng)處理后的幼蟲(chóng)相較于對(duì)照組生長(zhǎng)周期延遲3～5d，成蟲(chóng)的體重下降約50%，產(chǎn)卵量也有不同程度的降低（20.5%～88.3%）。進(jìn)一步對(duì)H1和H14進(jìn)行生物測(cè)定結(jié)果表明，這兩種化合物對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)具有不同程度的抑制活性，且隨著抑制劑濃度的增加，幼蟲(chóng)的平均體重下降。濃度為125umol/L時(shí)第7天H1和H14處理組的死亡率分別為46%和50%（表1）。

4總結(jié)與展望

由于傳統(tǒng)農(nóng)藥在使用中產(chǎn)生的一系列問(wèn)題，新型殺蟲(chóng)劑成為更符合人類(lèi)發(fā)展的新選擇。通過(guò)抑制SCP-2來(lái)達(dá)到殺蟲(chóng)的目的是研發(fā)新型殺蟲(chóng)劑的有效途徑。目前大量研究都集中于蚊子中，但由于不同昆蟲(chóng)的SCP-2結(jié)構(gòu)存在一定的差異，所以對(duì)于其他害蟲(chóng)SCP-2抑制劑的研究還有待加強(qiáng)。篩選新的SCP-2抑制劑，需要根據(jù)不同物種的SCP-2進(jìn)行活性位點(diǎn)的分析，找到其活性氨基酸殘基，同時(shí)還需要考慮蛋白質(zhì)的變構(gòu)效應(yīng)，應(yīng)當(dāng)使用與配體結(jié)合后SCP-2的構(gòu)象進(jìn)行對(duì)接分析。結(jié)合親和力的影響因素包括靜電作用、溶劑化作用與反溶劑化作用、受體配體本身的分子結(jié)構(gòu)改變等。運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)方法對(duì)結(jié)合親和力進(jìn)行評(píng)價(jià)后選出候選抑制劑。目前已篩選出來(lái)的抑制劑對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、變態(tài)發(fā)育和繁殖都表現(xiàn)出一定的抑制作用。在動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)中，部分抑制劑對(duì)小鼠無(wú)毒害作用但其對(duì)環(huán)境和人體的影響還未經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。在確定對(duì)環(huán)境和人體無(wú)明顯影響后，還要對(duì)其成藥性進(jìn)行研究，直至形成殺蟲(chóng)劑產(chǎn)品。綜上所述，在新型殺蟲(chóng)劑領(lǐng)域，基于SCP-2抑制劑的新型殺蟲(chóng)劑研究具有巨大空問(wèn)和潛力。