入侵云南草地貪夜蛾的分子鑒定

張磊 靳明輝 張丹丹 姜玉英 劉杰 吳孔明 蕭玉濤

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摘要草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（J.E Smith）是一種原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要農(nóng)業(yè)入侵害蟲，目前已從緬甸進(jìn)入我國(guó)云南西南部地區(qū)，且呈現(xiàn)蔓延之勢(shì)。對(duì)入侵物種快速準(zhǔn)確鑒定是早期預(yù)警和監(jiān)測(cè)預(yù)防的關(guān)鍵。本研究采用分子標(biāo)記手段，對(duì)采自云南5個(gè)縣（市）的83份樣品進(jìn)行鑒定，通過(guò)PCR擴(kuò)增細(xì)胞色素C氧化酶第1亞基（COI）和磷酸甘油醛異構(gòu)酶（Tpi）兩個(gè)基因片段并進(jìn)行序列測(cè)定分析。結(jié)果表明，基于CA）I基因片段的序列比對(duì)能夠?qū)Σ莸刎澮苟赀M(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定，并且能夠?qū)ζ浣捶N甜菜夜蛾等進(jìn)行鑒定?；赮pi基因序列的特異單倍型位點(diǎn)比較分析，確認(rèn)入侵我國(guó)的草地貪夜蛾均為“玉米型”。該研究為草地貪夜蛾的快速識(shí)別提供了方法支持，同時(shí)為進(jìn)一步的蟲源地解析和遺傳溯源積累了寶貴的前期數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞草地貪夜蛾;DNA條碼;單倍型;亞群

中圖分類號(hào)：S 435.132文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2019121

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda，也稱秋黏蟲，具有雜食性、遷飛性、暴發(fā)性的特點(diǎn)。該蟲廣泛分布于美洲大陸，雖然在熱帶和亞熱帶地區(qū)以外區(qū)域不能越冬存活，由于其遠(yuǎn)距離遷飛能力，在溫度適中的夏季和秋季，其危害范圍能夠向北延伸至加拿大。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的發(fā)展，國(guó)際交流和進(jìn)出口貿(mào)易成為生物入侵的一個(gè)主要通道。草地貪夜蛾于2016年在非洲首次被發(fā)現(xiàn)，兩年時(shí)問(wèn)內(nèi)迅速擴(kuò)散至撒哈拉以南幾乎44個(gè)國(guó)家，造成嚴(yán)重的玉米減產(chǎn)。2018年5月草地貪夜蛾首次確認(rèn)侵入印度，2018年底已經(jīng)在緬甸形成蟲源基地，并通過(guò)中緬邊境零星進(jìn)入我國(guó)云南境內(nèi)，嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食作物安全生產(chǎn)。

準(zhǔn)確迅速地進(jìn)行物種識(shí)別，是外來(lái)入侵生物綜合防控的關(guān)鍵技術(shù)。夜蛾科灰翅夜蛾屬Spodoptera包含有多種重要農(nóng)業(yè)害蟲，包括常見(jiàn)的甜菜夜蛾S ex-igua和斜紋夜蛾S.litura等，均具有雜食性、分布廣泛等特點(diǎn)，由于形態(tài)特征相近，僅從外形難以區(qū)分，給傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定帶來(lái)一定的挑戰(zhàn)，且傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法受到蟲態(tài)、亞群、單倍型等影響，很容易與其他近緣物種混淆，急需開發(fā)分子手段，補(bǔ)充形態(tài)學(xué)鑒定的局限性，達(dá)到快速準(zhǔn)確鑒定的目的。

當(dāng)前針對(duì)草地貪夜蛾分子鑒定的主要標(biāo)記有擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length poly-morphisms，AFLP）、線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基工基因（cytochrome c oxidase subunit I COD。以及位于Z染色體上的磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因（tri-ose-phosphate isomerase，Zpi）。其中基于線粒體OOI基因的序列分析是目前最常用也是最有效的分子條碼，基于個(gè)別SNP位點(diǎn)的比對(duì)還能夠達(dá)到鑒別草地貪夜蛾不同亞型的目的。研究顯示草地貪夜蛾雌性“水稻型”和雄性“米型”存在一定比例的雜交，由于線粒體母系遺傳的特征，因此往往容易造成分子鑒定結(jié)果的不一致。除CO工基因外，位于Z染色體的rpi基因也是草地貪夜蛾鑒定的標(biāo)記基因，該標(biāo)記由于位于核基因組，與寄主植物相關(guān)性更強(qiáng)，且在不同亞型鑒定上顯示出比線粒體標(biāo)記更加準(zhǔn)確的特性。將兩種標(biāo)記鑒定方法有機(jī)結(jié)合，互為補(bǔ)充，互相驗(yàn)證，可保證鑒定結(jié)果更加可靠。

本研究利用COI和Tpi兩個(gè)基因片段對(duì)入侵我國(guó)的草地貪夜蛾進(jìn)行分子鑒定，探究該物種的快速識(shí)別技術(shù)，對(duì)于進(jìn)一步明確其蟲源信息及其發(fā)生特征和暴發(fā)規(guī)律，以及指導(dǎo)草地貪夜蛾的監(jiān)測(cè)預(yù)警和早期控制具有重大意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本次研究的樣品一共有83份，采集地點(diǎn)包括云南省德宏州的瑞麗市、芒市、隴川縣、盈江縣和普洱市江城縣等5個(gè)縣（市），寄主均為苗期至抽雄初期的冬玉米，每個(gè)地點(diǎn)樣品數(shù)2份至35份不等，所有樣品均為幼蟲。樣品采集后放入泡沫箱，活體常溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，采用新鮮玉米葉片喂養(yǎng)，具體樣品信息見(jiàn)表1。

1.2DNA提取及PCR擴(kuò)增

樣品DNA提取采用Muifisource Genomic DNAMiniprep Kit試劑盒，單頭蟲體用液氮研磨后，按照說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作，純化的DNA經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，使用NanoDrop ND-2000儀器測(cè)定濃度，用作PCR擴(kuò)增模板。

分別對(duì)CO工基因和gpi基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表2，采用全式金2×EasyTQq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下（50uL）：DNA模板5uL，正反向引物各1.5uL，2×EasyTaq mix25uL，dd H217uL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，34個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃變性30S，60℃退火30S，72℃延伸1min，72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，使用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，選取與目標(biāo)片段長(zhǎng)度一致的單一片段PCR產(chǎn)物送生工生物工程（3a海）股份有限公司切膠測(cè)序，測(cè)序引物采用各自片段PCR擴(kuò)增引物。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用SeqMan和BioEdit軟件對(duì)正反向測(cè)序序列進(jìn)行人工拼接及峰圖校正，獲得準(zhǔn)確的CO工和Zpi基因片段序列。同時(shí)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載已經(jīng)發(fā)布的草地貪夜蛾對(duì)應(yīng)基因序列以及Spo-doptera屬近緣物種的對(duì)應(yīng)基因序列，去除低質(zhì)量序列，所有核酸序列采用MEGA5.0軟件進(jìn)行比對(duì)，截去兩端多余的序列，選取Kimura-2參數(shù)模型，依據(jù)鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各分支的自舉檢驗(yàn)值（bootstrap）1000次重復(fù)檢驗(yàn)。針對(duì)已經(jīng)報(bào)道的基于Tpi基因序列的“玉米型”和“水稻型”單倍型特點(diǎn)，運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行特異位點(diǎn)差異比對(duì)，以此確認(rèn)本研究草地貪夜蛾具體的亞型。

2結(jié)果與分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增，CO工引物及gpi引物在所有83份樣品中均得到很好的擴(kuò)增效果，條帶單一整齊，其中COI基因片段長(zhǎng)度約800bp，Ypi基因片段長(zhǎng)度約400bp，均與預(yù)期片段大小一致（圖1）。該結(jié)果表明兩種基因片段均適合作為草地貪夜蛾分子鑒定的DNA條碼，引物顯示出很強(qiáng)的種屬擴(kuò)增特異性。

通過(guò)序列測(cè)定和峰圖校正分析，得到了所有83份樣品準(zhǔn)確的CO工基因片段和Tpi基因片段序列，其中COI片段長(zhǎng)度均為789bp，除了采自芒市的1號(hào)樣品之外，其余82份樣品的COI序列完全一致。Tpi片段長(zhǎng)度為386～388bp，其中芒市的1號(hào)樣品序列長(zhǎng)度為388bp，其余82份樣品的序列長(zhǎng)度均為386bp且序列完全一致。序列比對(duì)結(jié)果顯示芒市1號(hào)樣品與其余樣品的CO工序列相似度為92.9%，ypi序列相似度僅為83.76%，表明芒市1號(hào)樣品極有可能為不同的物種，而其余82份樣品為同一物種。

根據(jù)本研究測(cè)定的CO工序列及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的18條Spodoptera屬近緣物種COI序列，以棉鈴蟲Helicoverpa armigera COI序列作為外群，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），由于本研究中有82份樣品序列完全一致，僅選取瑞麗1號(hào)樣品作為代表。

從系統(tǒng)樹可以看出，COI基因片段能夠?qū)podoptera屬不同個(gè)體按照各自所屬的物種明顯地區(qū)分開來(lái)，來(lái)自同一物種的不同個(gè)體均優(yōu)先聚在一起，且各分支均具有較高的支持率。其中采自云南的樣品與之前研究發(fā)表的草地貪夜蛾聚為一支，表明云南的所有82份樣品均為草地貪夜蛾，而采自芒市的1號(hào)樣品與甜菜夜蛾聚為一支，可將芒市1號(hào)樣品鑒定為甜菜夜蛾。且從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，草地貪夜蛾與S.d0lichos和S.pulchella顯示出更近的親緣關(guān)系。

將本研究測(cè)定的草地貪夜蛾Tpi基因序列與之前研究發(fā)表的兩種亞型對(duì)應(yīng)的Tpi基因序列進(jìn)行單倍型比對(duì)分析，結(jié)果顯示在能夠區(qū)分“水稻型”和“玉米型”的10個(gè)多態(tài)性單倍型中，云南樣品在所有10個(gè)位點(diǎn)與“玉米型”單倍型完全一致（圖3），證明所鑒定的82份草地貪夜蛾樣品均為“玉米型”。鑒于本研究采樣地點(diǎn)全部來(lái)自玉米種植區(qū)，因此更加確認(rèn)早期入侵我國(guó)的草地貪夜蛾屬于“玉米型”。

3討論

草地貪夜蛾作為一種入侵性極強(qiáng)的毀滅性害蟲，其入侵風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、快速識(shí)別技術(shù)和監(jiān)測(cè)預(yù)防工作顯得尤為重要。當(dāng)前，由草地貪夜蛾的快速擴(kuò)散和嚴(yán)重為害引發(fā)全球關(guān)注，多國(guó)已經(jīng)啟動(dòng)應(yīng)急處置預(yù)案，聯(lián)合制定綜合治理方案，歐洲已將其作為檢疫害蟲。由于我國(guó)并沒(méi)有草地貪夜蛾本地種，此次草地貪夜蛾從緬甸入侵我國(guó)，如不引起足夠重視，一旦全面暴發(fā)，后果將難以控制，給我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

草地貪夜蛾在原產(chǎn)地美洲長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中分化成兩種生態(tài)型，根據(jù)取食寄主植物的不同分為“玉米型”和“水稻型”，前者主要取食玉米和高梁，后者主要取食水稻和狗牙根等草坪草。這兩種生態(tài)型在雌性性信息素成分、交配行為等生理學(xué)方面具有較為明顯的差異，然而兩種亞型之問(wèn)并沒(méi)有絕對(duì)的生殖隔離，有報(bào)道顯示兩種亞型之問(wèn)存在一定比例的雜交，給基于生理學(xué)差異和基于寄主選擇性的表型鑒定帶來(lái)更多的不確定性，并且兩種亞型在外部形態(tài)特征上基本一致，無(wú)法進(jìn)行有效的形態(tài)學(xué)區(qū)分，目前開發(fā)分子標(biāo)記是對(duì)兩種亞型進(jìn)行區(qū)分的最有效手段。除此之外，草地貪夜蛾在低齡幼蟲期以及卵階段難以與其他近緣物種進(jìn)行區(qū)分，也需要借助分子手段的輔助鑒定。對(duì)入侵害蟲進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定分型，明確其為害特征，有助于提前科學(xué)布局和開展針對(duì)性的防控措施，減少農(nóng)林經(jīng)濟(jì)損失，因此，開展基于分子輔助手段的鑒定工作很有必要且意義重大。

本研究采用分子標(biāo)記手段，對(duì)入侵我國(guó)的草地貪夜蛾進(jìn)行了準(zhǔn)確的物種鑒定。所選取的兩個(gè)片段在所有樣品均得到較好的擴(kuò)增，表明兩種標(biāo)記都能夠達(dá)到對(duì)該物種進(jìn)行快速鑒定的目的。同時(shí)，本研究采用的引物通用性強(qiáng)，對(duì)甜菜夜蛾DNA也能進(jìn)行有效擴(kuò)增，可以應(yīng)用于Spodo ptera屬近緣物種的分子鑒定。且進(jìn)一步通過(guò)Tpi基因序列特異位點(diǎn)單倍型分析，確認(rèn)入侵我國(guó)的草地貪夜蛾為“玉米型”。由于本次研究的82份草地貪夜蛾樣品COI和Tpi兩個(gè)基因片段序列完全一致，推測(cè)入侵云南5個(gè)縣（市）的草地貪夜蛾均來(lái)自同一蟲源地，或侵入中國(guó)之后進(jìn)行的擴(kuò)散。

作為一種國(guó)際性重大遷飛農(nóng)業(yè)害蟲，當(dāng)前針對(duì)草地貪夜蛾的研究日益增多，采用COI和TPI等分子條碼能夠有效地對(duì)草地貪夜蛾進(jìn)行物種鑒定，很容易與其他物種進(jìn)行區(qū)分。但是，對(duì)于“玉米型”和“水稻型”的區(qū)分依然是研究的難點(diǎn)，當(dāng)前也僅僅是依靠個(gè)別基因有限SNP位點(diǎn)的單倍型進(jìn)行鑒定，由于草地貪夜蛾遷飛性強(qiáng)且分布廣泛，候選基因往往變異速率快，不少研究表明在相關(guān)位點(diǎn)出現(xiàn)雜合的現(xiàn)象，給鑒定分型帶來(lái)困擾。一直以來(lái)針對(duì)兩種亞型分析的方法也不斷改進(jìn)，對(duì)鑒定的準(zhǔn)確性要求不斷提高，然而，依然需要開發(fā)更多與取食寄主關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，達(dá)到鑒定的系統(tǒng)性和多重驗(yàn)證。盡管目前兩種亞型的基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)布，然而關(guān)于兩者取食不同寄主直接的基因和相關(guān)機(jī)制并未闡明，因此僅能通過(guò)與表型性狀關(guān)聯(lián)的分子特征進(jìn)行亞型區(qū)分。

兩種不同亞型的草地貪夜蛾往往同時(shí)發(fā)生，目前非洲已經(jīng)有兩種亞型的定殖為害。本研究雖然鑒定入侵我國(guó)云南地區(qū)的草地貪夜蛾均為“玉米型”，但是由于取樣地點(diǎn)和取樣數(shù)目的局限性，并不能完全排除“水稻型”草地貪夜蛾已經(jīng)侵入我國(guó)，需要做好更大范圍的監(jiān)測(cè)和調(diào)查。此外，關(guān)于本次研究的草地貪夜蛾的最初來(lái)源仍需要進(jìn)一步確認(rèn)，通過(guò)序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)樹從而分析源頭的方法已證實(shí)可行。由于緬甸以及中國(guó)并沒(méi)有草地貪夜蛾本地種，需要深入厘清其來(lái)源，從源頭進(jìn)行控制和管理，明確草地貪夜蛾發(fā)生動(dòng)態(tài)規(guī)律，為指導(dǎo)草地貪夜蛾的科學(xué)防控提供更加可靠的信息。