PK結(jié)腸溶膠囊對(duì)犬結(jié)腸炎的療效評(píng)價(jià)

(貴陽(yáng)市南明區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550002)

消化系統(tǒng)疾病是犬的多發(fā)病，其中犬結(jié)腸炎多因細(xì)菌感染、化學(xué)刺激、應(yīng)激反應(yīng)、結(jié)腸黏膜機(jī)械性損傷、過(guò)食、食物過(guò)敏或不耐受等原因造成[1，2]。潰瘍性結(jié)腸炎(UC)以結(jié)腸的彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變?yōu)樘攸c(diǎn)，出現(xiàn)腹瀉、便血、黏液增多和腹痛等癥狀，并且緩解與發(fā)作相互交替[3]。PK結(jié)腸溶膠囊是大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院新開發(fā)的1種藥品，主要特點(diǎn)為膠囊在結(jié)腸內(nèi)溶解，直接作用于患處。本試驗(yàn)制作犬的急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，綜合評(píng)價(jià)口服PK結(jié)腸溶膠囊的療效，為犬結(jié)腸炎的治療探索更安全有效的治療藥物及療效判斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物：健康中華田園犬成年犬16只，體重10～15 kg，雌雄各半。

1.1.2飼養(yǎng)管理：試驗(yàn)犬在同一棟標(biāo)準(zhǔn)化圈舍內(nèi)單籠飼養(yǎng)，逐頭稱重并佩戴耳標(biāo)建立檔案，飼喂相同分量的日糧及水，預(yù)飼2周后注射犬英特威寵必威@優(yōu)免康四聯(lián)苗(犬瘟熱、傳染性肝炎、細(xì)小病毒病、副流感，批號(hào)：A507A01)，再次確定健康后進(jìn)入正式試驗(yàn)。

1.1.3藥品試劑與實(shí)驗(yàn)儀器：(1)藥品試劑：PK結(jié)腸溶膠囊(大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院惠贈(zèng))、淀粉結(jié)腸溶膠囊、柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊、淀粉、乙酸、生理鹽水、復(fù)方新潔爾滅消毒液、犬眠寶、75%醫(yī)用酒精、碘酒、EDTA、10%MgSO4。(2)儀器用品：全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀(Exigo，瑞典，SN-61564)、9215電子內(nèi)窺鏡、愛(ài)德士生化分析儀(IDEXX Vet Test，美國(guó)，OK51015)、C-反應(yīng)蛋白測(cè)量?jī)x(USHIO INC Point-reader V，日本，AMD02A)、生物顯微鏡、常規(guī)手術(shù)器械及用品、燒杯、量杯、彈簧度盤秤、載玻片、蓋玻片。

1.2 方法

1.2.1分組：試驗(yàn)犬隨機(jī)分為4組(每組4只，雌雄各半)，即陰性藥物組(淀粉結(jié)腸溶膠囊1顆/kg)、正常劑量組(PK結(jié)腸溶膠囊1顆/kg)、 2倍劑量組(PK結(jié)腸溶膠囊2顆/kg)、陽(yáng)性藥物組(柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊1顆/kg)。

1.2.2制備動(dòng)物模型：在造模前 1 d，使用10%MgSO4溶液按照 5 mL/kg體重對(duì)所有試驗(yàn)犬灌腸后，禁食不禁水24 h。造模當(dāng)日，使用犬眠寶按照 0.15 mL/kg體重對(duì)所有實(shí)驗(yàn)犬肌肉注射進(jìn)行全身麻醉后，參照乙酸誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠實(shí)驗(yàn)制備動(dòng)物模型方法[4]，用聚乙烯導(dǎo)管自肛門伸入犬結(jié)腸 20 cm，緩慢注入7%乙酸溶液灌腸，保持犬頭低尾高的姿態(tài) 15 s，用生理鹽水 50 mL沖洗使乙酸溶液排出。

1.2.3分組給藥：造模后第 1 d，將空腹試驗(yàn)犬頭部抬高并打開口腔，對(duì)準(zhǔn)舌根部喂服各試驗(yàn)藥物。陰性藥物組喂服淀粉結(jié)腸溶膠囊 1 顆/kg，正常劑量組喂服PK結(jié)腸溶膠囊 1顆/kg，2 倍劑量組喂服PK結(jié)腸溶膠囊 2 顆/kg，陽(yáng)性藥物組喂服柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊 1 顆/kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定

1.3.1血樣采集：采血前向集血容器中加入適量EDTA抗凝劑，采集頸靜脈血2 mL，冰箱4 ℃保存，送檢過(guò)程避免血樣劇烈震蕩。

1.3.2白細(xì)胞總數(shù)檢測(cè)：使用Exigo全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組給藥后第 1 d、第 4 d、第 7 d 血樣的白細(xì)胞總數(shù)(WBC)。

1.3.3C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)：用USHIO INC Point-reader V(C-反應(yīng)蛋白測(cè)量?jī)x)檢測(cè)各組給藥后第 1 d、第4 d、第 7 d 血樣的血清CRP含量。

1.3.4內(nèi)窺鏡檢查：用內(nèi)窺鏡在造模前、造模后及給藥后第 1 d、第 4 d、第7 d對(duì)試驗(yàn)犬結(jié)腸進(jìn)行觀察，記錄結(jié)腸黏膜潰瘍、潰爛和出血等情況。

2 結(jié)果

2.1 制備動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果內(nèi)窺鏡觀察可見(jiàn)：造模前犬結(jié)腸黏膜呈粉紅色，黏膜表面光滑，無(wú)病變。造模后犬結(jié)腸黏膜充血、水腫，有炎性彌漫性浸潤(rùn)，腸壁凸凹不平，形成潰瘍面，說(shuō)明動(dòng)物模型制備成功。

2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2.1WBC檢測(cè)結(jié)果：(1)陰性藥物組給藥后第1 d，WBC為(23.825±3.113)×109/L；第 4 d為(24.275±4.182)×109/L；第7 d為(21.075±3.004)×109/L。(2)陽(yáng)性藥物組給藥后第 1 d，WBC為(23.805±13.831)×109/L；第 4 d為(16.800±4.645)×109/L，恢復(fù)到正常范圍(6×109/L～17×109/L)，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(13.550±2.767)×109/L。(3)正常劑量組給藥后第 1 d，WBC為(24.275±4.920)×109/L；第 4 d 為(21.823±7.889)×109/L；第7 d 為(18.050±0.893)×109/L。(4)2倍劑量組給藥后第 1 d，WBC為(25.000±12.884)×109/L；第 4 d為(11.250±5.540)×109/L，恢復(fù)到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(10.600±2.688)×109/L，較正常劑量組、陽(yáng)性藥物組差異極顯著(P<0.01)。見(jiàn)表1、圖1。血常規(guī)檢測(cè)WBC變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，根據(jù)是否存在差異顯著性，可反映藥物是否成功治療潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的臨床意義。結(jié)果表明：2倍劑量PK結(jié)腸溶膠囊效果最好。

表1 犬WBC檢測(cè)結(jié)果 ×109/L

注：各組間肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖1 犬WBC檢測(cè)柱形圖

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，無(wú)標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2.2CRP檢測(cè)結(jié)果：(1)陰性藥物組給藥后第1 d，CRP為(103.775±16.747)mg/L；第4 d 為(97.600±29.676)mg/L；第7 d為(36.425±8.764)mg/L。(2)陽(yáng)性藥物組給藥后第 1 d，CRP為(99.125±23.367)mg/L；第4 d 為(67.450±41.758)mg/L；第7 d為(14.500±2.783)mg/L。(3)正常劑量組給藥后第1 d，CRP為(93.575±17.547)mg/L；第4 d 為(60.125±18.164)mg/L；第7 d為(18.450±7.303)mg/L。(4)2 倍劑量組給藥后第 1 d，CRP為(103.675±28.430)mg/L；第4 d為(48.150±19.549)mg/L，較正常劑量組、陽(yáng)性藥物組差異顯著(P<0.05)；第 7 d為(7.975±2.425)mg/L，恢復(fù)到正常范圍(1～10 mg/L)，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。CRP的檢測(cè)結(jié)果對(duì)藥物治療犬結(jié)腸炎療效的觀察具有臨床意義。CRP在乙酸誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)明顯增加，在給藥后第4 d、第7 d 隨炎癥消退而迅速下降。結(jié)果表明： 2倍劑量PK結(jié)腸溶膠囊效果最好。

表2 犬CRP檢測(cè)結(jié)果 mg/L

圖2 犬CRP檢測(cè)柱形圖

2.3WBC、CRP相關(guān)性分析結(jié)果各組相關(guān)方程式參考價(jià)值從高到低排序?yàn)椋赫┝拷M(r=0.998 2)>陰性藥物組(r=0.977 3)>陽(yáng)性組(r=0.938 5)>2倍劑量組(r=0.924 4)。相關(guān)系數(shù)r的大小決定了WBC、CRP 2個(gè)變量相關(guān)的密切程度，當(dāng)r越接近1時(shí)，表示相關(guān)的方程式參考價(jià)值越高。結(jié)果表明：各組WBC和CRP呈正相關(guān)，均可作為犬結(jié)腸炎存在、嚴(yán)重程度、抗炎治療效果的非特異性指標(biāo)。

2.4 內(nèi)窺鏡觀察結(jié)果

2.4.1給藥后第 1 d：陰性藥物組(見(jiàn)圖3a)結(jié)腸黏膜出血、彌漫性充血、色澤鮮紅；陽(yáng)性藥物組(見(jiàn)圖3b)結(jié)腸黏膜屏障受損，組織細(xì)胞壞死導(dǎo)致黏膜面變粗糙；正常劑量組(見(jiàn)圖3c)結(jié)腸黏膜上形成點(diǎn)狀糜爛和多發(fā)性小潰瘍；2倍劑量組(見(jiàn)圖3d)結(jié)腸黏膜局部可見(jiàn)漿液彌漫性浸潤(rùn)。表明給藥后第 1 d，4組實(shí)驗(yàn)犬療效均不明顯。

2.4.2給藥后第 4 d：陰性藥物組(見(jiàn)圖4a)結(jié)腸黏膜水腫和充血依然可見(jiàn)，潰瘍?cè)钸吘夡w積基本沒(méi)有減小跡象；陽(yáng)性藥物組(見(jiàn)圖4b)結(jié)腸黏膜組織細(xì)胞粗糙、壞死，邊緣體積減小；正常劑量組(見(jiàn)圖4c)結(jié)腸黏膜水腫緩解，點(diǎn)狀糜爛腸黏膜開始愈合；2 倍劑量組(見(jiàn)圖4d)結(jié)腸黏膜局部滲出液體成分被腸黏膜吸收，潰瘍面積和程度大幅減輕，但炎灶瘢痕邊緣分界仍明顯可見(jiàn)。表明給藥后第 4 d，4組實(shí)驗(yàn)犬療效最好的是2倍劑量組，正常劑量組和陽(yáng)性藥物組腸黏膜愈合程度大體一致。

a.陰性藥物組 b.陽(yáng)性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組圖3 給藥后第1 d結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查結(jié)果

a.陰性藥物組 b.陽(yáng)性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組 圖4 給藥后第4 d結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查結(jié)果

2.4.3給藥后第 7 d：陰性藥物組(見(jiàn)圖5a)結(jié)腸黏膜出血水腫情況有所減輕；陽(yáng)性藥物組(見(jiàn)圖5b)及正常劑量組(見(jiàn)圖5c)結(jié)腸黏膜糜爛和潰瘍?cè)钜呀?jīng)完成組織細(xì)胞修復(fù)，依稀可見(jiàn)留下的痕跡；2倍劑量組(見(jiàn)圖5d)結(jié)腸黏膜色澤基本恢復(fù)正常，肉眼觀察無(wú)明顯病灶。表明給藥后第7 d，4組實(shí)驗(yàn)犬療效最好的是2倍劑量組，正常劑量組略好于陽(yáng)性藥物組。

a.陰性藥物組 b.陽(yáng)性藥物組 c.正常劑量組 d.2倍劑量組圖5 給藥后第7 d結(jié)腸內(nèi)窺鏡檢查結(jié)果

3 討論

3.1 乙酸致犬潰瘍性結(jié)腸炎模型的制備本實(shí)驗(yàn)參考腸腔灌注法制作乙酸致犬急性潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，是目前實(shí)驗(yàn)性UC模型中應(yīng)用最廣泛的模型之一，遵循了模型容易制備并且可以重復(fù)以及模型在病理上能反映疾病兩大要點(diǎn)。由于乙酸溶液的化學(xué)刺激，作為病理學(xué)致炎因子引起炎性充血和刺激性充血，發(fā)生充血的腸黏膜色澤鮮紅，炎灶邊緣體積輕度增大。因小血管壁的通透性增高，炎灶內(nèi)的微量液體成分通過(guò)血管基底膜緩慢滲出在腸黏膜上或者彌漫性浸潤(rùn)于腸黏膜上，可見(jiàn)漿液，局部炎性水腫并發(fā)生腸黏膜屏障受損、組織細(xì)胞壞死，形成潰瘍面。參考夏冰等[5]的研究，前期準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中曾經(jīng)試用4%、7%、10%乙酸溶液等不同濃度的實(shí)驗(yàn)試劑造模，從腸內(nèi)壁黏膜損傷情況是否容易觀察、能否有效指向研究目的等方面考慮，最終選擇7%乙酸溶液制備結(jié)腸炎臨床病例模型后，由胃腸鏡從肛門深入結(jié)腸，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎癥程度隨乙酸濃度增加而加重，而7%乙酸溶液既可導(dǎo)致犬結(jié)腸炎，又不致炎癥太重，前期試驗(yàn)結(jié)果符合夏冰等提出的最佳致炎濃度4%～8%的結(jié)論。

3.2CRP與犬的急性潰瘍性結(jié)腸炎C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein ，CRP)是1930年由Tillett首先在急性大葉性肺炎患者血清中所發(fā)現(xiàn)的1種蛋白質(zhì)，它在Ca2+存在下，同肺炎鏈球菌細(xì)胞壁上的 C多糖能飽和地結(jié)合在一起，發(fā)生沉淀反應(yīng)，故命名CRP。CRP是急性炎癥或組織嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)出現(xiàn)的1種異常蛋白質(zhì)，在急性炎癥時(shí)數(shù)小時(shí)內(nèi)明顯增加，1～3 d可達(dá)到最高值(增加100～3 000倍)，故又稱為“急性期蛋白”。本實(shí)驗(yàn)取犬頸靜脈血，用C-反應(yīng)蛋白測(cè)量?jī)x分別檢查給藥后第1 d、第4 d、第7 d采集血樣的血清CRP含量，結(jié)果表明：陰性藥物組、正常劑量組、2倍劑量組、陽(yáng)性藥物組CRP在乙酸誘導(dǎo)急性潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)明顯增加，在給藥后第4 d及第7 d隨炎癥消退而迅速下降。在給藥后第1 d、第4 d、第7 d分別以內(nèi)窺鏡觀察腸道炎癥的范圍與程度，記錄炎癥發(fā)生后腸黏膜潰瘍的整個(gè)愈合過(guò)程，除陰性藥物組外，其他3組實(shí)驗(yàn)犬急性潰瘍性結(jié)腸炎疾病經(jīng)過(guò)的內(nèi)窺鏡觀察結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血清中CRP數(shù)據(jù)變化情況一致。CRP檢測(cè)結(jié)果快，操作更簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，能真實(shí)反映犬結(jié)腸炎臨床癥狀的變化。CRP的檢測(cè)已經(jīng)在人醫(yī)的臨床廣泛應(yīng)用，包括急性感染性疾病的診斷和鑒別診斷、手術(shù)后感染的監(jiān)測(cè)、抗生素療效的觀察、病程檢測(cè)及預(yù)后判斷等[6]。故認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中CRP結(jié)果可以作為犬結(jié)腸炎存在、嚴(yán)重程度、抗炎治療效果的非特異性指標(biāo)之一。

3.3 內(nèi)窺鏡對(duì)犬結(jié)腸炎臨床診斷的臨床意義結(jié)腸鏡的適應(yīng)癥包括：原因不明的便血或者糞潛血陽(yáng)性；臨床疑為結(jié)腸腫瘤；結(jié)腸疑有息肉，或者X射線檢測(cè)發(fā)現(xiàn)息肉需要鑒別良性或惡性者；各種原因的腹瀉、疑有潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病或者慢性痢疾，慢性結(jié)腸炎者；結(jié)腸手術(shù)后的復(fù)查及術(shù)前確定病變范圍者。只要臨床出現(xiàn)便血或者糞潛血陽(yáng)性而原因不明時(shí)，就是結(jié)腸鏡檢查的適應(yīng)癥[7]。2012年廣州炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)正式明確了結(jié)腸鏡檢查并活檢是潰瘍性結(jié)腸炎診斷的主要依據(jù)[8]。由于犬潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀主要發(fā)生在黏膜當(dāng)中的彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變，最主要的癥狀包括腹瀉、結(jié)腸直腸出血、黏液增多和腹痛。對(duì)犬的結(jié)腸炎臨床診斷時(shí)，利用內(nèi)窺鏡從肛門深入結(jié)腸即可直接觀察到結(jié)腸黏膜表面的組織變化。本實(shí)驗(yàn)是否成功建立乙酸誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎臨床動(dòng)物模型病例、口服給藥后各組實(shí)驗(yàn)犬結(jié)腸黏膜的愈合情況以及對(duì)PK結(jié)腸溶膠囊治療犬結(jié)腸炎的療效評(píng)價(jià)都與內(nèi)窺鏡觀察結(jié)果密切相關(guān)，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中能通過(guò)內(nèi)窺鏡對(duì)病變部位取活檢病理學(xué)檢查，對(duì)于提高動(dòng)物臨床確診率具有很大的意義。

3.4PK結(jié)腸溶膠囊治療犬結(jié)腸炎的療效

3.4.1造模給藥后第4 d內(nèi)窺鏡觀察：2倍劑量組腸炎灶內(nèi)滲出的液體成分被腸黏膜吸收，潰瘍面積和程度大幅減輕，但炎灶瘢痕邊緣分界仍明顯可見(jiàn)。通過(guò)血常規(guī)檢查：2倍劑量組WBC恢復(fù)到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)；CRP下降幅度為53.56%，較正常劑量組、陽(yáng)性藥物組差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明對(duì)于犬結(jié)腸炎的臨床治療，PK結(jié)腸溶膠囊2倍劑量組治療效果更優(yōu)于正常劑量組。

3.4.2造模給藥后第7 d內(nèi)窺鏡觀察：2倍劑量組結(jié)腸黏膜已恢復(fù)到動(dòng)物健康時(shí)粉色帶正常光澤。血常規(guī)檢查：2 倍劑量組WBC恢復(fù)正常，較正常劑量組、陽(yáng)性藥物組差異極顯著(P<0.01)；CRP也恢復(fù)到正常范圍，較正常劑量組差異顯著(P<0.05)，而陽(yáng)性藥物組CRP尚未恢復(fù)正常。說(shuō)明PK結(jié)腸溶膠囊治療犬急性潰瘍性結(jié)腸炎效果優(yōu)于柳氮磺吡啶結(jié)腸溶膠囊。

4 結(jié)論

4.1口服PK結(jié)腸溶膠囊治療犬急性潰瘍性結(jié)腸炎，治療期間CRP和WBC都顯著下降，2者呈正相關(guān)關(guān)系。

4.2CRP檢測(cè)結(jié)果可作為結(jié)腸炎存在、嚴(yán)重程度、抗炎治療效果的非特異性指標(biāo)。

4.3PK結(jié)腸溶膠囊以 2顆/kg劑量治療犬結(jié)腸炎療效明顯，其效果優(yōu)于1顆/kg的正常劑量和柳氮磺吡啶。