維生素E對果蠅輻射氧化損傷機制的影響

賀特 馬云 王五洲 賀俊彥 蔣雨薇 曹旭琴 何淑雅,

1南華大學衡陽醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室 421001；2南華大學公共衛(wèi)生學院放射醫(yī)學教研室，衡陽 421001

輻射與各種化學物質結合造成的危害是現(xiàn)代生活不可避免的[1]。在日本福島核事故等核災難發(fā)生后，由于環(huán)境受到放射性污染，公眾對輻射暴露的健康風險越來越關注。在毒理學研究中，動物模型被廣泛地應用。然而，其成本和許可等問題限制了其在大規(guī)模藥物篩選過程中被使用[2]，為了盡量減少使用高等動物，替代模型變得非常重要。果蠅是一種無脊椎動物，基因組被廣泛研究，且果蠅是一種完全變態(tài)的生物體，其毒性可在胚胎、幼蟲、蛹和成蟲的不同發(fā)育階段表現(xiàn)出來[3]。因此，果蠅適合作為動物模型而應用于大規(guī)模藥物篩選。

電離輻射對果蠅的大部分有害影響主要是通過它的間接作用，即通過作用于水分子產生自由基，如羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等，從而使果蠅體內各種生物大分子（如 DNA、RNA 和蛋白質等）的結構和功能發(fā)生改變，最終導致致命性的細胞損傷，這是果蠅輻射損傷的主要形式[4]。有研究報道線粒體是細胞內超氧化物產生的主要場所，且同時維生素E在線粒體中的濃度也是最高的，維生素E缺陷型動物的骨骼肌細胞最早出現(xiàn)的癥狀之一就是線粒體的損壞[5]。線粒體中維生素E的存在對限制超氧化物的生成起著關鍵作用。維生素E可以通過降低細胞中線粒體超氧化物的生成、清除已生成的超氧化物和穩(wěn)定線粒體膜，達到降低線粒體超氧化物水平的目的[6]。本研究主要目的是評估維生素E是否能夠提高果蠅幼蟲的抗輻射損傷和抗氧化損傷的能力。鑒于維生素E具有抗氧化作用，確定維生素E是否可以作為哺乳動物的輻射保護劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：3-羥基苯甲酸甲酯（上海生工生物工程有限公司），冰醋酸、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（湖南匯虹試劑有限公司），維生素E（北京博奧拓達科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物有限公司），過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司）。儀器：137Cs γ生物輻照儀（HXFSIA，中國核動力研究設計院設備制造廠），Synergy TMHT酶標儀（美國BIO-TEK公司），Eppendorf冷凍離心機（德國Eppendorf有限公司），-80℃超低溫冰箱（美國Thermo scientific公司）。

1.2 果蠅幼蟲的培養(yǎng)

W-118野生型果蠅由湖南師范大學生命科學院吳秀山教授惠贈。果蠅從胚胎發(fā)育到成蟲大約需要10 d。收集受精的雌性果蠅，產卵限制在4 h，丟棄雌性果蠅，以獲得均勻樣品。卵在培養(yǎng)室中孵育72 h，用20%蔗糖溶液以梯度密度把幼蟲從培養(yǎng)基中分離，獲得第二齡幼蟲。將幼蟲放至裝有蔗糖培養(yǎng)基溶液的玻璃瓶中，備用。

1.3 維生素E處理

在裝有濾紙盤和在10%蔗糖溶液中添加3.5 mL濃度分別為0、100、500、1000、1500 mg/L維生素E溶液，對幼蟲進行24 h處理。每12 h更換一次濾紙，24 h后收獲第三齡幼蟲。

1.4 分組及照射

將培養(yǎng)瓶中的三齡幼蟲分為10組，每組3管，每管100只。將2個5組分別分為對照組和100、500、1000、1500 mg/L維生素E組，其中1個5組放置于生物輻照儀中進行照射，每分鐘輻照劑量約為1.9 Gy，輻照50 Gy；另1個5組不進行照射，將未受照射和照射后的果蠅同時放在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每5 d更換一次培養(yǎng)基。

1.5 蛹化率和羽化率的測定

每隔6 h觀察照射后幼蟲的形態(tài)變化，以確定蛹化率和羽化率。蛹化率=蛹的總數(shù)/幼蟲數(shù)×100%，羽化率=羽化果蠅的總數(shù)/幼蟲數(shù)×100%。

1.6 羽化后48h死亡率的測定

在幼蟲羽化為成蟲后，每隔12 h觀察其存活數(shù)量直至48 h，以確定死亡率。死亡率=死亡果蠅的總數(shù)/羽化果蠅的總數(shù)×100%。

1.7 果蠅攀爬能力的測定

收集羽化后4～5 d的成蟲，輕拍培養(yǎng)管使果蠅置于培養(yǎng)管底部，果蠅攀爬的運動區(qū)域設定為培養(yǎng)管底部距頂部棉塞5 cm 之間的區(qū)域，記錄10 s內果蠅攀爬到5 cm的百分比。

1.8 氧化應激的標記檢測

采用生化分析方法對三齡幼蟲的氧化壓力進行評價。每組設置3個重復，每個重復50只果蠅幼蟲，加入10倍果蠅重量的PBS，在冰上研磨制備幼蟲組織勻漿，4 ℃下3500 r/ min離心（半徑為7.8 cm）15 min，采用 GSH和 CAT試劑盒測定GSH活力和CAT活力。

1.9 統(tǒng)計學分析

用SPSS19.0軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。果蠅幼蟲的蛹化率、羽化率、CAT 活力、GSH含量和成蟲的攀爬能力、羽化后48 h內的死亡率在符合正態(tài)分布的情況下用表示，在方差齊的條件下各組間的比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度維生素E對照射后果蠅幼蟲蛹化率的影響

由圖1可見，在50 Gy γ射線照射后，不同濃度維生素E處理后的果蠅幼蟲的蛹化率與單純照射對照組比較均明顯升高，500、1000、1500 mg/L的維生素E組的蛹化率分別從（43.00±2.00）%增加至 （52.66±2.52）%、（67.00±3.61）%和 （71.33±4.04）%，且差異均有統(tǒng)計學意義；而未受照射的果蠅幼蟲，隨著維生素E濃度的增加，其蛹化率隨之降低，差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 不同濃度維生素E對受照后果蠅幼蟲羽化率的影響

由圖2可見，隨著維生素E濃度的增加，果蠅幼蟲在50 Gy γ射線照射后的羽化率與單純照射的對照組比較明顯增加，分別從（38.36±1.48）%增加至（44.33±2.08）%、（50.00±4.00）%、（62.67±2.08）%、（63.33±3.06）%，且差異均有統(tǒng)計學意義。

圖1 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲蛹化率的影響 圖中，#：與0 Gy對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.250、6.325、4.427、4.690，均 P＜0.05）；*：與 50 Gy 單純照射對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.209，P=0.006；t=10.082，P=0.001；t=10.883，P=0.000）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.1 Effect of different concentrations of vitamin E on pupation rate of gamma-ray irradiation on drosophila melanogaster larvae

圖2 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲羽化率的影響 圖中，#：與0 Gy對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.942，P=0.042）；*：與50 Gy單純照射的對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.402，P=0.016；t=4.723，P=0.009；t=16.462，P=0.000；t=12.732，P=0.000）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.2 Effects of different concentrations of vitamin E on the eclosion rate of drosophila melanogaster larvae after gamma irradiation

2.3 不同濃度維生素E對受照后果蠅幼蟲48h死亡率的影響

由圖3可見，在50 Gy γ射線照射后，與未照射對照組比較，1000 mg/L和1500 mg/L維生素E組的果蠅幼蟲羽化為成蟲48 h內的死亡率分別從（54.0±5.0）% 降低至（36.1±7.6）% 和（37.5±5.8）%，且差異均有統(tǒng)計學意義。

2.4 不同濃度維生素E對受照果蠅幼蟲攀爬能力的影響

由圖4可見，與單純照射對照組比較，1000 mg/L和 1500 mg/L維生素 E組果蠅幼蟲受照后攀爬能力百分比從（24.33±1.52）%升高至（30.00±2.00）% 和（30.67±3.51）%，差異均有統(tǒng)計學意義。

圖3 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲48 h死亡率的影響 圖中，*：與50 Gy單純照射的對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.386，P=0.028；t=3.718，P=0.021）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.3 Effects of different concentrations of vitamin E on mortality of drosophila melanogaster larvae at 48 h after gamma irradiation

圖4 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲攀爬能力的影響 圖中，*：與50 Gy單純照射的對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.900，P=0.018；t=2.864，P=0.046）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.4 Effects of different concentrations of vitamin E on climbing ability of fruit fly larvae after gamma-ray irradiation at different doses

2.5 不同濃度維生素E對受照果蠅幼蟲GSH含量的影響

由圖5可見，維生素E濃度分別為500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L處理的果蠅幼蟲在γ射線照射后GSH含量與單純照射的對照組比較有明顯增加，從（47.43±2.06）μmoL /mg 增加至（57.00±2.70）、（62.8±1.71）、（62.6±2.31）μmoL /mg，差異均有統(tǒng)計學意義。這說明維生素E可影響受到照射的果蠅幼蟲GSH含量。

2.6 不同濃度維生素E對受照果蠅幼蟲CAT活力的影響

由圖6可見，隨著維生素E濃度從100 mg/L至1500 mg/L的增加，γ射線照射后CAT活力與單純照射對照組比較明顯增加，從（39.70±0.95）U/mg升高至（344.7±1.00）、（47.33±2.72）、（54.43±2.90）、（51.00±3.25）U/mg，且差異均有統(tǒng)計學意義。這說明果蠅幼蟲在受到照射后維生素E可使CAT的含量升高。

3 討論

圖5 不同濃度維生素E對γ射線照射的果蠅幼蟲谷胱甘肽含量的影響 圖中，*：與50 Gy照射的對照組比較，差異均有 統(tǒng) 計 學 意 義 （ t=4.911，P=0.008；t=9.955，P=0.001；t=8.611，P=0.001）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.5 Effects of different concentrations of vitamin E on glutathione content in gamma-ray larvae irradiated with different doses of radiation

圖6 不同濃度維生素E對γ射線照射的果蠅幼蟲過氧化氫酶活力的影響 圖中 *：與50 Gy照射的對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t=6.303，P=0.003；t=4.913，P=0.008；t=8.357，P=0.001；t=5.820；P=0.004）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.6 Effects of different concentrations of vitamin E on catalase activity of fly larvae exposed to gamma rays at different doses

近年來，隨著放射治療為基礎的臨床診斷和癌癥放療的增多，輻射對人體的有害程度也有所增加。電離輻射在本質上是有害的，會造成間接的DNA損傷。目前，輻射源廣泛應用于治療、診斷、能源、戰(zhàn)爭中。核恐怖主義、在外層空間或空中旅行等活動中，利用藥物提高輻射抗性，是保護正常組織不受電離輻射的有害影響的一種方法，特別是那些可以作為自由基清除劑和抗氧化劑的天然來源的化合物，能夠減少或減輕電離輻射帶來的有害影響[7]。

輻射防護劑是一種化合物，具有減少輻射對正常組織的影響，可以降低因電離輻射導致疾病的發(fā)病率和病死率。其在臨床放射治療中也有實際用途，因為正常組織應受到保護，防止輻射損傷，大量化合物在體外實驗中表現(xiàn)出良好的放射防護作用，但由于急性毒性和不良反應，大部分化合物不適合在體內應用[3]?；瘜W物質可以通過清除生物體內的自由基從而減少DNA鏈斷裂的形成。其可以通過與自由基的反應來阻止自由基的形成或破壞自由基，從而抑制自由基與生物體內分子的反應和輻射暴露時間[8]。真核生物具有減少氧化損傷的抗氧化系統(tǒng)，如限制自由基產生的酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶）。這些物質的存在對真核生物的輻射防護具有重要意義[9]。除了酶以外，真核生物還可以通過飲食補充抗氧化劑來防止自由基的破壞，包括維生素A、維生素C、維生素E、多酚、花青素、黃酮類化合物和異硫氰酸酯等，水果、蔬菜和飲料中的化學物質可以通過不同的機制提供細胞的抗氧化活性[10]。有研究結果表明，維生素E在提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤和癌癥、預防心血管疾病等領域均具有顯著的作用[11]。

有研究結果發(fā)現(xiàn)，高劑量的X射線導致果蠅的蛹化率和羽化率降低，從而抑制果蠅的發(fā)育[12]，果蠅生殖細胞暴露于X射線和γ射線會誘導致死突變，同時也會干擾活性氧（ROS）的穩(wěn)態(tài)，導致活性氧的過度產生，從而導致DNA損傷[13]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，果蠅幼蟲在受到照射后蛹化率和羽化率、攀爬能力均降低，羽化后48 h的死亡率升高，體內GSH含量和CAT活力減少，與之前的研究結果相符[12-14]。這表明γ射線輻照誘發(fā)的自由基氧化損傷機制可能是通過降低果蠅體內抗氧化酶活力和非酶組分等增加了活性氧和脂質過氧化物的生成，使氧化損傷不斷加劇，從而影響果蠅抵抗氧化損傷的能力，造成果蠅蛹化率和羽化率的下降、死亡率的上升。對于未受到照射的果蠅，維生素E組與對照組的GSH含量和CAT活力相比較沒有顯著的變化，造成此現(xiàn)象的原因可能是本研究選取的實驗對象與其他文獻報道的不同，其次因為果蠅在不同的生長發(fā)育時期各種蛋白的表達可能具有時空性，故其潛在的機制還需進一步的研究。本研究結果表明，維生素E預處理可以緩解高劑量輻射對果蠅造成的氧化應激和DNA損傷，提高受照后果蠅幼蟲的蛹化率和羽化率，維生素E通過減輕氧化應激從而改善果蠅的抗輻射能力，驗證了維生素E具有輻射防護作用。本研究為輻射防護劑的研發(fā)提供了參考。