耳蝸移植神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定*

吳佳源 劉俊

神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)定向分化及其在臨床上的應(yīng)用已成為21世紀(jì)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。感音神經(jīng)性聾是耳鼻咽喉科常見病之一，該病嚴(yán)重影響患者的聽覺(jué)功能及生活質(zhì)量。目前幫助中重度聽力損失患者提高聽力的唯一方法是使用人工耳蝸或助聽器去直接刺激聽神經(jīng)，但這都受限于復(fù)雜的聽力損傷機(jī)制和組織損傷程度[1]。耳蝸毛細(xì)胞的變性、壞死是導(dǎo)致永久性感音神經(jīng)性聾的主要原因[2]，在哺乳動(dòng)物中，毛細(xì)胞一旦死亡便不會(huì)再生[3]。如果能讓耳蝸毛細(xì)胞再生變成可能，那么這將會(huì)給耳聾的治療帶來(lái)重大突破。內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生由其前體細(xì)胞分裂、分化而來(lái)，毛細(xì)胞的前體細(xì)胞有以下幾種來(lái)源[4]: ①耳蝸感覺(jué)上皮內(nèi)的支持細(xì)胞：支持細(xì)胞分裂、增殖、分化為毛細(xì)胞；或者直接形態(tài)轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞；②受損區(qū)周圍的毛細(xì)胞，如亞急性損傷毛細(xì)胞的自我修復(fù)；③基底乳頭周圍的非感覺(jué)性上皮細(xì)胞分化；④聽覺(jué)上皮耳蝸多能干細(xì)胞的分化；⑤神經(jīng)干細(xì)胞的分化。可見，通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞移植有可能再生耳蝸內(nèi)的毛細(xì)胞，為感音神經(jīng)性聾患者帶來(lái)康復(fù)希望。因此，本研究以SD孕鼠的胎鼠海馬組織為原材料來(lái)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，擬為后續(xù)干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕14～15 d的SD大鼠3只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、青-鏈霉素溶液(濃度為100 IU/ml)購(gòu)于上海生工生物工程有限公司;EGF(20 μg)、bFGF(10 μg)購(gòu)于Peprotech公司;B27添加劑(50×)購(gòu)于Thermo Fisher公司；DEME/F12(1∶1)、TrypLTM Express(1×)購(gòu)于Gibco公司;

1.1.3神經(jīng)干細(xì)胞鑒定的主要試劑 鼠抗NSE(1∶100)多克隆抗體，鼠抗GFAP多克隆抗體(1∶100)，Brdu、鼠抗Brdu單克隆抗體(1∶100)，兔抗Nestin多克隆抗體(1∶100)，Cy3標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶100)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶100)均購(gòu)自武漢博士德公司。

1.1.4主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)，倒置顯微鏡(奧林巴斯)，熒光顯微鏡(日本蔡司)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精)。

1.2神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.2.1神經(jīng)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液的配制 取DMEM/F12(1∶1)100 ml，加入EGF(20 ng/ml)、bFGF(20 ng/ml)、B27添加劑(2%)、谷氨酰胺(2 mmol/L)、青-鏈霉素溶液1 ml(濃度為100 IU/ml)。配好后4 ℃保存。培養(yǎng)基應(yīng)保持新鮮，一般一次配制100 ml并在1周內(nèi)用完。

1.2.2血清培養(yǎng)基的配制 DMEM/F12(1∶1):90%、胎牛血清：10%。4 ℃保存。

1.2.3神經(jīng)干細(xì)胞提取 取孕14～15 d SD大鼠，用戊巴比妥進(jìn)行腹腔麻醉，放置于 75% 醫(yī)用酒精中完全浸泡消毒 5 min，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌間; 剪開孕鼠腹腔，暴露并取出子宮，放入培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái);除去子宮和胎膜，仔細(xì)分離出胎鼠海馬，用常溫PBS漂2次，盡量將腦膜剝除干凈。用眼科剪將腦組織剪成細(xì)小碎塊，然后將其移到10 ml離心管中(一個(gè)腦組織配一支試管)。離心(1 000 r/min，2 min)后丟棄上清液，在試管中加入2倍腦組織體積的TrypLTM Express(1×)，在37 ℃水浴下輕柔振蕩5 min，加入DEME/F12(1∶1)至試管刻度5 ml，用吸管輕柔吹打，經(jīng)200×細(xì)胞篩過(guò)濾，離心(1 000 r/min，5 min)丟棄上清液。再用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕柔吹打數(shù)次以形成單細(xì)胞懸液。以密度1×106ml-1(臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，不計(jì)死亡細(xì)胞)接種于25 cm2的透氣培養(yǎng)瓶中然后置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.4神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 在倒置顯微鏡下觀察并記錄培養(yǎng)細(xì)胞的狀況，如培養(yǎng)液的顏色、雜質(zhì)情況，培養(yǎng)細(xì)胞的密度、折光度以及神經(jīng)球形成大小、折光度等。然后根據(jù)情況隔1～2 d離心(1 000 r/min，5 min)后半量換液，再視神經(jīng)球生長(zhǎng)大小情況進(jìn)行傳代，一般4天左右傳代，傳代時(shí)全部換液。為了解神經(jīng)干細(xì)胞的增殖狀態(tài)，待培養(yǎng)3～4代后對(duì)每代的神經(jīng)球個(gè)數(shù)及直徑進(jìn)行測(cè)量。采用美國(guó)圖像處理軟件(image processing plus system 6.0)檢測(cè)神經(jīng)球個(gè)數(shù)，每樣本隨機(jī)選擇12個(gè)神經(jīng)球測(cè)量平均直徑。

1.3神經(jīng)干細(xì)胞鑒定方法

1.3.1NSCs的Nestin免疫組化熒光鑒定 將傳至第3代且培養(yǎng)成神經(jīng)球的神經(jīng)干細(xì)胞置入裝有0.1%多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片的24孔板中,然后置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，過(guò)夜后收獲貼壁細(xì)胞，用FITC標(biāo)記免疫熒光法檢測(cè)巢蛋白(nestin)的表達(dá)。方法如下：用1×PBS洗3次(5 min/次)；4%的多聚甲醛固定20 min；丟棄固定液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；用0.25%TritonX-100破膜10分鐘；丟棄破膜液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；用5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原(封閉液蓋過(guò)蓋破片即可),室溫孵育30分鐘，丟棄封閉液，盡量吸干殘液,不用PBS洗；滴加1∶100稀釋度的兔抗nestin多克隆抗體(一抗),4 ℃濕盒孵育過(guò)夜；丟棄一抗，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶100)，室溫孵育1小時(shí)；丟棄二抗，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；挑起蓋玻片后，貼有細(xì)胞的一面向下蓋上已加入抗熒光猝滅劑的載玻片(注意不要產(chǎn)生氣泡)；在熒光顯微鏡下觀察、照相并記錄。

1.3.2Brdu摻入試驗(yàn) 培養(yǎng)的第3代神經(jīng)干細(xì)胞懸液行Brdu標(biāo)記。在機(jī)械分離傳代時(shí)，按6 μg/ml(20 μmol/L)的濃度在NSCs懸液加入Brdu。按1.3.1的方法進(jìn)行處理并收獲細(xì)胞，用Nesein與Brdu免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)鑒定，方法如下：用1×PBS洗3次(5 min/次)；用90%乙醇/1%冰乙酸固定10分鐘；用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘夜；用0.25%TritonX-100破膜10分鐘；丟棄破膜液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；0.4%胃酶消化室溫20分鐘；2N鹽酸室溫處理30分鐘；丟棄鹽酸，吸干殘液，硼砂(0.1 mol/L)室溫中和10分鐘；丟棄硼砂，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原,室溫孵育30分鐘；丟棄封閉液，吸干殘液，不用PBS洗，加入鼠抗BrdU和兔抗Nestin一抗混合液,4 ℃濕盒反應(yīng)36 h；丟棄一抗混合液，用1XPBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔和Cy3標(biāo)記的羊抗鼠的二抗混合液,室溫孵育3 h。丟棄二抗混合液，用1×PBS洗3次(5 min/次),盡量吸干殘液；挑起蓋玻片后，貼有細(xì)胞的一面向下蓋上已加入抗熒光猝滅劑的載玻片(注意不要產(chǎn)生氣泡)；在免疫熒光顯微鏡下觀察、照相并記錄。

1.3.3熒光染料Hoechest33342標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞 培養(yǎng)的第3代NSCs懸液離心800 r/5 min,離去上清液，細(xì)胞沉淀重新加入無(wú)血清培養(yǎng)基，機(jī)械吹打均勻后加入用1×PBS溶解Hoechst33342,終濃度為10 μg/ml,37 ℃，反應(yīng)2 h,將標(biāo)記細(xì)胞離心沉淀并用新鮮培養(yǎng)液清洗2次，每次離心5 min,并反復(fù)吹打使其變成單細(xì)胞，在熒光顯微鏡下查看細(xì)胞核標(biāo)記情況。

1.3.4誘導(dǎo)分化NSCs及其鑒定 將經(jīng)熒光染料標(biāo)記后的NSCs按1.3.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)并收獲細(xì)胞，用FITC標(biāo)記免疫熒光法檢測(cè)巢蛋白(Nestin)的表達(dá)，同時(shí)觀察其細(xì)胞核中熒光染料標(biāo)記后的藍(lán)色熒光的表達(dá)。NSCs 的誘導(dǎo)分化：將培養(yǎng)的、經(jīng)熒光燃料標(biāo)記的第2代NSCs反復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，置入裝有0.1%多聚賴氨酸處理過(guò)蓋玻片的24孔板中,培養(yǎng)條件為: 血清培養(yǎng)基，37 ℃,5%CO2,每 2～3 d換液一次，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，4～5 d后可收獲分化細(xì)胞。用Cy3標(biāo)記免疫熒光法檢測(cè)分化后細(xì)胞的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，星狀膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)的胞漿蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原2，3-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNP)，同時(shí)觀察其細(xì)胞核中熒光染料標(biāo)記后的藍(lán)色熒光的表達(dá)。Cy3 標(biāo)記免疫熒光法方法同1.3.1(步驟分別滴加1∶100稀釋度鼠抗GFAP多克隆抗體、鼠抗CNP多克隆抗體及鼠抗NSE多克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜)。

2 結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 由孕14～15 d的胎鼠海馬組織分離、培養(yǎng)的細(xì)胞, 初代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞以橢圓形為主，表面可見絨毛，細(xì)胞折光性強(qiáng)，呈懸浮生長(zhǎng)。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞呈球形增長(zhǎng),生長(zhǎng)速度快、活性好(圖1)。在培養(yǎng)過(guò)程中，隨著細(xì)胞球體積的不斷增大，部分細(xì)胞球可融合，有的細(xì)胞球中央部分由于缺少營(yíng)養(yǎng)，而出現(xiàn)“老化”，透光性變差(圖2)。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)傳8代以上仍可繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，活性好。第4～9代神經(jīng)干細(xì)胞球的數(shù)量和直徑見表1。

表1 第4～9代神經(jīng)干細(xì)胞球的數(shù)量(個(gè))和直徑

2.2大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果

經(jīng)行Brdu 與 Nestin 的免疫熒光雙標(biāo)染色，可見神經(jīng)干細(xì)胞球Brdu 與 Nestin 均為陽(yáng)性(圖3a、b)。

用Hoechst33342熒光染料標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞后用FITC標(biāo)記免疫熒光法檢測(cè)巢蛋白(Nestin)的表達(dá)，同時(shí)觀察其細(xì)胞核中熒光染料標(biāo)記后的藍(lán)色熒光的表達(dá)(4a、b)。

熒光染料標(biāo)記后的神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)含10%的胎牛血清(不含生長(zhǎng)因子)的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞團(tuán)2～4 h開始貼壁,貼壁的細(xì)胞分化,并由NSCs團(tuán)發(fā)出呈放射狀生長(zhǎng)的細(xì)胞(圖5、6)。

用Cy3標(biāo)記免疫熒光法檢測(cè)分化后細(xì)胞的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原(CNP)的表達(dá)，同時(shí)觀察其細(xì)胞核中熒光染料標(biāo)記后的藍(lán)色熒光的表達(dá)(圖7～9)。

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞可以從發(fā)育中的大腦區(qū)域中分離獲得，包括大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和嗅覺(jué)上皮[5，6]，其具有自我更新能力和多能性。移植的神經(jīng)干細(xì)胞被證明可以遷移到腦損傷部位并分化成原生的細(xì)胞類型，如少突膠質(zhì)細(xì)胞[7]、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、皮質(zhì)神經(jīng)元[8]和脊髓神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元[9]，表明神經(jīng)干細(xì)胞既能替換損壞的神經(jīng)組織，又能恢復(fù)損傷后的功能。

被植入的神經(jīng)干細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)上的不同取決于它們?cè)诙亙?nèi)所處的位置，這表明耳蝸內(nèi)的微環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)展起到重要的作用?？梢约僭O(shè)，一旦這個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞系遷移到耳蝸內(nèi)，接受到來(lái)自微環(huán)境的信號(hào)后，這些細(xì)胞便表達(dá)由內(nèi)耳細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞基因命運(yùn)程序，并對(duì)該程序進(jìn)行正反饋和負(fù)反饋調(diào)節(jié)以達(dá)到平衡。這同時(shí)也說(shuō)明成年的哺乳動(dòng)物耳蝸內(nèi)還保留著一些信號(hào)，這些信號(hào)對(duì)于干細(xì)胞沿著耳蝸的表型分化是很有必要的，盡管這些信號(hào)并不能作用于內(nèi)耳的細(xì)胞群使它們?cè)偕鸀槊?xì)胞[10]?？梢?，通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞移植有可能再生耳蝸毛細(xì)胞，從而為感音神經(jīng)性聾患者的康復(fù)帶來(lái)希望。

圖1 SD大鼠NSCs球(×200) 圖2 “老化”的NSCs球(×200) 圖3 a.NSCs球Nestin陽(yáng)性,FITC標(biāo)記成綠色熒光(熒光顯微鏡×200);b.同一視野下細(xì)胞核Brdu陽(yáng)性,Cy3標(biāo)記成紅色熒光(熒光顯微鏡×200) 圖4 a.熒光染料標(biāo)記后NSCs呈Nestin陽(yáng)性,FITC標(biāo)記成綠色熒光(熒光顯微鏡×200);b.同一視野下細(xì)胞核Hoechst熒光染料呈藍(lán)色熒光(熒光顯微鏡×200) 圖5 貼壁的神經(jīng)細(xì)胞球 圖6 貼壁分化的神經(jīng)干細(xì)胞 圖7 a.Cy3標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP(紅色熒光);b.同一視野下細(xì)胞核Hoechst熒光染料呈藍(lán)色熒光 圖8 a.Cy3標(biāo)記神經(jīng)元特異性蛋白NSE(紅色熒光);b.同一視野下細(xì)胞核Hoechst熒光染料呈藍(lán)色熒光 圖9 a.Cy3少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原CNP(紅色熒光);b.同一視野下細(xì)胞核Hoechst熒光染料呈藍(lán)色熒光

研究顯示，培養(yǎng)基中添加 bFGF 和 EGF 2種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)常用的絲裂原，二者聯(lián)合使用能夠在短時(shí)期內(nèi)培養(yǎng)出大量神經(jīng)干細(xì)胞[11]；添加B27( 不含維生素 A) ，可避免神經(jīng)干細(xì)胞在增殖過(guò)程中出現(xiàn)分化現(xiàn)象和維持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)[12]。本實(shí)驗(yàn)從孕14～15 d SD大鼠的胎鼠腦海馬組織分離培養(yǎng)得來(lái)的細(xì)胞,采用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng),結(jié)果細(xì)胞具有很強(qiáng)的分裂、增殖及自我更新能力。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞傳代時(shí)能否將神經(jīng)球吹打成單細(xì)胞懸液至關(guān)重要，神經(jīng)球中的神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞骨架蛋白、特異的鈣連蛋白等形成黏附連接，單純依靠機(jī)械吹打很難將神經(jīng)球打散，若不能打散，則會(huì)極大影響下一代細(xì)胞的數(shù)量。目前，細(xì)胞傳代時(shí)主要使用的是胰酶消化法，但是胰酶的消化作用容易造成神經(jīng)干細(xì)胞的化學(xué)性損傷，而使用血清或酶抑制劑對(duì)抗胰酶的消化作用，也可能會(huì)降低神經(jīng)干細(xì)胞的活力和增殖率，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。故本實(shí)驗(yàn)使用熱穩(wěn)定性更強(qiáng)、細(xì)胞毒性更低、作用更溫和的TrypLTM Express，其和胰酶有相同的作用位點(diǎn)，是一種高純度的重組酶，不需要用血清或酶抑制劑對(duì)抗其消化作用。本實(shí)驗(yàn)中，先將細(xì)胞用TrypLTM Express在37 ℃下作用5 min，然后用3 ml的吸管輕柔吹打，可以比較容易地獲得單細(xì)胞懸液。吹打過(guò)程中動(dòng)作要輕柔，勿用力過(guò)猛，否則容易損傷細(xì)胞。傳代的時(shí)機(jī)對(duì)能否獲取高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液也很重要，如果傳代時(shí)神經(jīng)球體積過(guò)大，則細(xì)胞間的細(xì)胞連接非常緊密，神經(jīng)球很難被吹散，若強(qiáng)行分離，則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞破壞、溶解、死亡以及貼壁分化；如果傳代時(shí)神經(jīng)球體積過(guò)小，雖然比較容易將神經(jīng)球吹散，但獲得的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量偏少。本實(shí)驗(yàn)一般在培養(yǎng)4～5天后傳代，但具體要視細(xì)胞球的生長(zhǎng)速度。

Nestin是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞的主要骨架蛋白，也稱為巢蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞的主要鑒定指標(biāo)之一。由于Nestin還存在于其它細(xì)胞，如某些腫瘤細(xì)胞及胰腺祖細(xì)胞等，故對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定還要看它是否可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及能否分裂增殖，只有滿足上述條件的細(xì)胞才算是神經(jīng)干細(xì)胞[13]。神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物分別為特異性烯醇化酶(NSE)、胞漿蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、2，3-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNP)。神經(jīng)干細(xì)胞在胎牛血清作用下，可分化為NSE表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元樣細(xì)胞、GFAP表達(dá)陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞及CNP表達(dá)陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞，說(shuō)明培養(yǎng)出的NSCs具有多向分化能力。BrdU作為胸腺嘧啶的衍生物，常用來(lái)標(biāo)記活細(xì)胞中合成的DNA，可穩(wěn)定復(fù)制到子代細(xì)胞中，從而可用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)傳培養(yǎng)代3次的神經(jīng)干細(xì)胞，Nestin和BrdU均表達(dá)陽(yáng)性。Hoechst是雙間二氮茚類物資，為特異性的DNA染料，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，可以對(duì)細(xì)胞核著色，在倒置熒光顯微鏡下發(fā)出藍(lán)色熒光，染色快(1～3 h)，標(biāo)記率可達(dá) 100%[14]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)胎鼠海馬組織來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行了培養(yǎng)及鑒定，結(jié)果顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞 Nestin 呈陽(yáng)性反應(yīng)，分化后細(xì)胞特異性標(biāo)志物NSE、GFAP、CNP表達(dá)陽(yáng)性，并且培養(yǎng)的細(xì)胞能夠分裂增殖，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞，為以后的神經(jīng)干細(xì)胞耳蝸移植試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。本文如果能對(duì)NSE+GFAP+CNP進(jìn)行多重免疫熒光標(biāo)記鑒定，則能更進(jìn)一步驗(yàn)證神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能，此為今后的研究方向。