小鼠耳蝸性聾的關(guān)鍵通路和差異表達(dá)基因分析△

楊媛媛 黃冠江 陶源

由于耳蝸部位的血液供應(yīng)相對(duì)較脆弱，一旦耳蝸供血障礙易引起耳蝸的病變，從而導(dǎo)致耳蝸性聾[1～4]，嚴(yán)重的耳蝸性聾患者的最佳治療是人工耳蝸植入術(shù)，但至今耳蝸性聾的相關(guān)機(jī)制仍不十分明確[5,6]。最新研究表明，早期給予外源性腦源性神經(jīng)因子可有效保護(hù)條件敲除縫隙鏈接蛋白26的小鼠耳蝸Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài),但對(duì)于聽(tīng)功能則無(wú)保護(hù)作用[7]。Yoshimura等[8]通過(guò)基因芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)POU4F3、Slc17a8、TMC1及Crym的突變可導(dǎo)致耳蝸性聾。為進(jìn)一步研究小鼠耳蝸性聾的關(guān)鍵通路、差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)及這些基因產(chǎn)物之間的相互作用，本研究采用數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘的方法進(jìn)行基因本體分析(gene ontology analysis,GO)、京都基因和基因組百科全書(shū)分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析(protein protein interaction network，PPI network)及基因集富集分析(gene set enrichment analysis， GSEA)，旨在拓展耳蝸性聾機(jī)制的研究思路，并為耳蝸性聾的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 從美國(guó)國(guó)立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus, GEO)下載小鼠耳蝸性聾基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)(GSE84735)，該芯片數(shù)據(jù)由東京大學(xué)的耳鼻咽喉科學(xué)者Kashio A和Someya S上傳，采用Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array平臺(tái)，芯片數(shù)據(jù)包含10個(gè)樣本，其中，耳蝸性聾小鼠樣本5例(實(shí)驗(yàn)組)，對(duì)照組小鼠樣本5例，均為2月齡。實(shí)驗(yàn)組小鼠均采用0.15%的GeO2喂養(yǎng)4個(gè)月，對(duì)照組小鼠采用正常飲食喂養(yǎng)。均經(jīng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)檢測(cè)證實(shí)，GeO2喂養(yǎng)后的實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的聽(tīng)力損失，而對(duì)照組小鼠無(wú)聽(tīng)力損失，在小鼠6月齡的時(shí)候，運(yùn)用微陣列技術(shù)分析CBA小鼠耳蝸基因的表達(dá)。

1.2分析方法

1.2.1數(shù)據(jù)處理及差異基因分析 運(yùn)用R軟件(版本3.5.1)進(jìn)行基因芯片分析。將原始CEL(CIM Fast Event Language)數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件，對(duì)耳蝸性聾組(實(shí)驗(yàn)組)和正常聽(tīng)力組(對(duì)照組)進(jìn)行差異比較，應(yīng)用affyPLM和affy程序包對(duì)原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，用RMA算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；從而應(yīng)用limma程序包對(duì)基因進(jìn)行篩選，選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。篩選條件：Fold Change的絕對(duì)值大于2，且P<0.05，然后，通過(guò)R軟件運(yùn)行g(shù)plots程序包，做可視化的火山圖。最后，使用Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/)對(duì)排名前50的上調(diào)和下調(diào)的差異基因做可視化的熱圖。

1.2.2GO分析和KEGG分析 GO是一種常用的注釋基因和識(shí)別生物學(xué)特性的有效方法[9, 10]。KEGG是一個(gè)對(duì)基因功能進(jìn)行系統(tǒng)分析的數(shù)據(jù)庫(kù)[11, 12],能對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析[13]。為了分析差異基因，在戴維數(shù)據(jù)庫(kù)(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, David) v6.8中，對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，且定義P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3差異基因互作網(wǎng)絡(luò)分析 交互基因的搜索工具(search tool for the retrieval of interacting genes,STRING)數(shù)據(jù)庫(kù)是用于評(píng)估蛋白質(zhì)相互作用信息的在線(xiàn)工具，String(版本10.5)涵蓋了來(lái)自2 031種生物體的960萬(wàn)種蛋白質(zhì)信息。為了評(píng)估DEGs之間的交互關(guān)系，本研究應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI network)，使用cytoHubba插件篩選出前10位的關(guān)鍵基因，同時(shí)使用分子復(fù)合檢測(cè)(molecular complex detection,MCODE)插件蛋白質(zhì)相互作用對(duì)網(wǎng)絡(luò)的模塊進(jìn)行分析；然后，對(duì)MCODE排名第一的模塊進(jìn)行KEGG通路分析，且定義P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4GSEA分析 采用GSEA軟件，對(duì)數(shù)據(jù)集GSE84735進(jìn)行基因集富集分析, Spearman相關(guān)系數(shù)為基因和樣本標(biāo)簽之間的基因的權(quán)重[14, 15]，按默認(rèn)的加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次；當(dāng)通路的錯(cuò)誤發(fā)生率(false discovery rate,FDR)<25%且P<0.01時(shí)，認(rèn)為通路具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1差異基因的表達(dá)分析結(jié)果 通過(guò)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠樣本對(duì)比，總共19 191個(gè)基因被納入研究。基于Fold change的絕對(duì)值大于2并P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出191個(gè)DEGs，其中，79個(gè)基因?yàn)槎佇悦@的上調(diào)DEGs，112個(gè)基因?yàn)槎佇悦@的下調(diào)DEGs(圖1)。對(duì)排名前50的上調(diào)和下調(diào)的DEGs做可視化的熱圖(圖2)。

圖1 差異基因的火山圖 紅色代表上調(diào)的DEGs,藍(lán)色代表下調(diào)的DEGs

2.2GO分析和KEGG分析結(jié)果 上傳所有的DEGs至在線(xiàn)分析工具-David數(shù)據(jù)庫(kù)，以識(shí)別GO分析和KEGG分析。GO分析結(jié)果顯示，在生物過(guò)程中，上調(diào)的DEGs顯著富集的生物過(guò)程包括：蛋白質(zhì)寡聚化的調(diào)節(jié)、先天免疫應(yīng)答、細(xì)胞趨化性、細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素-1的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)等(表1)；下調(diào)的DEGs顯著富集的生物過(guò)程包括：有絲分裂核分裂、細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、染色體分離及紅細(xì)胞分化等(表1)。在分子功能(molecular function,MF)方面，上調(diào)的DEGs顯著富集的分子功能包括：趨化因子受體結(jié)合、鋅離子結(jié)合、趨化因子活性、金屬肽酶活性及細(xì)胞因子活性；下調(diào)的DEGs顯著富集的分子功能包括：微管結(jié)合、組蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄抑制活性、RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端序列特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合及RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等(表1)。此外，在細(xì)胞成分(cell component,CC)方面，上調(diào)的DEGs顯著富集的細(xì)胞成分包括：細(xì)胞外空間和細(xì)胞外區(qū)；下調(diào)的DEGs顯著富集的細(xì)胞成分包括：著絲粒區(qū)染色體、著絲粒、紡錘體極、染色體及稠密染色體著絲粒等(表1)。

表1 小鼠耳蝸性聾差異表達(dá)基因的GO分析

KEGG分析結(jié)果顯示，上調(diào)的DEGs在腫瘤壞死因子信號(hào)通路中富集，而下調(diào)的DEGs在細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂及p53信號(hào)通路中富集(表2)。

2.3PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 基于String數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息，使用Cytoscape(版本3.6.1)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的繪制(圖3)，然后，使用插件cytoHubba對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選，排名前10的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(hub)包括Kif11、Cdc20、Cdk1、Bub1b、Ccnb2、Cdca8、Cdca5、Sgol1、Hmmr及Ncapg，其中，Kif11節(jié)點(diǎn)的度(degree)最高，為31。此外，使用插件MCODE對(duì)總共91個(gè)節(jié)點(diǎn)和516個(gè)邊界進(jìn)行了分析，選擇排名第1的子網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)中涉及的基因的重要通路(圖4，表3)，KEGG分析表明，DEGs主要與細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂、p53信號(hào)通路及病毒性癌變有關(guān)。

表2 小鼠耳蝸性聾差異表達(dá)基因的KEGG分析

表3 關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)中涉及的基因的重要通路的KEGG分析

圖3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4GSEA分析結(jié)果 GSEA分析結(jié)果顯示，共有17 541個(gè)基因集在小鼠耳蝸性聾表型中表達(dá)上調(diào)，其中560個(gè)FDR<25%，621個(gè)P<0.01；共有1 836個(gè)基因集在小鼠耳蝸性聾表型中表達(dá)下調(diào)，其中703個(gè)FDR<25%，683個(gè)P<0.01；如圖5所示，前三位上調(diào)的通路包括樹(shù)突狀細(xì)胞成熟A(圖5a)、Cronquist Nras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖5b)及反應(yīng)金屬離子SLC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖5c)；而前三位下調(diào)的通路包括半乳糖代謝(圖5d)、氧化磷酸化(圖5e)及嘌呤代謝(圖5f)。

3 討論

Qiao等[16]研究了巨細(xì)胞病毒對(duì)小鼠耳蝸的破壞機(jī)制，耳蝸的組織病理學(xué)檢查顯示前庭膜中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平增加，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)到鼓膜中較高水平的TNF-α和IL-6；Zou等[17]研究了振動(dòng)引起的聽(tīng)力損失相關(guān)動(dòng)物模型的細(xì)胞和分子機(jī)制，證實(shí)耳蝸性聾與TNF-α及其受體的上調(diào)有關(guān)；Riva等[18]同樣驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)；Tadros等[19]研究了隨年齡增長(zhǎng)和聽(tīng)力損失程度加重的小鼠耳蝸中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，證實(shí)耳蝸性聾與P53相關(guān)。本研究從GEO數(shù)據(jù)集中表達(dá)譜數(shù)據(jù)(GSE84735)檢索到5個(gè)小鼠耳蝸性聾的樣本和5個(gè)正常聽(tīng)力的樣本，研究中共確定191個(gè)差異表達(dá)基因。為了更好地研究DEGs的相互作用，本研究進(jìn)行了GO分析和KEGG分析；在GO分析中，上調(diào)的DEGs主要參與細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)及CXCR趨化因子受體結(jié)合等過(guò)程，下調(diào)的DEGs主要參與有絲分裂核分裂、細(xì)胞周期及細(xì)胞分裂等過(guò)程；在KEGG分析中，上調(diào)的DEGs主要參與腫瘤壞死因子信號(hào)通路，下調(diào)的DEGs主要參與細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂及p53信號(hào)通路等。

圖4 關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)

圖5 GSEA分析結(jié)果 a、b、c為前三位上調(diào)通路,d、e、f為前三位下調(diào)通路

本研究還構(gòu)建了DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，并列出了前10個(gè)關(guān)鍵基因：Kif11、Cdc20、Cdk1、Bub1b、Ccnb2、Cdca8、Cdca5、Sgol1、Hmmr及Ncapg。Kif11被確定為具有最高連接度的關(guān)鍵基因，Kif11是一種蛋白質(zhì)編碼基因，編碼驅(qū)動(dòng)蛋白樣蛋白家族的運(yùn)動(dòng)蛋白，其基因產(chǎn)物的功能包括染色體定位、中心體分離和建立雙極紡錘體。Kovacovicova等[20]的一項(xiàng)研究顯示，Kif11能保持雙極紡錘體結(jié)構(gòu)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟；Johnson等[21]的研究表明KIf11參與有絲分裂紡錘體的形成過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)次級(jí)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。Cdc20一般在細(xì)胞周期中調(diào)節(jié)多種蛋白相互作用，在染色體分離和有絲分裂結(jié)束中具有重要功能[22]；其他關(guān)鍵基因Cdk1、Bub1b、Ccnb2、Cdca8、Cdca5、Sgol1、Hmmr及Ncapg的研究，目前仍缺乏相關(guān)文獻(xiàn)。Buniello等[23]發(fā)現(xiàn)wbp2表達(dá)缺失導(dǎo)致小鼠漸進(jìn)性高頻耳蝸性聾；Menardo等[24]發(fā)現(xiàn)SAMP8菌株能促使小鼠耳聾和耳蝸退化提前出現(xiàn)，還原人類(lèi)耳蝸性聾的過(guò)程，促使SAMP8小鼠提前出現(xiàn)耳聾的相關(guān)分子機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、抗氧化酶水平的改變和復(fù)合物I、II和IV的活性降低，同時(shí)這些也導(dǎo)致了慢性炎癥和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。所以，耳蝸性聾的關(guān)鍵基因仍需要進(jìn)一步研究。

本研究差異表達(dá)基因工作網(wǎng)絡(luò)圖的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析顯示耳蝸性聾的差異基因與細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂、p53信號(hào)通路及病毒性癌變有關(guān)，但相關(guān)文獻(xiàn)目前仍缺乏；所以，耳蝸性聾的關(guān)鍵基因仍需要進(jìn)一步研究。GSEA分析的結(jié)果顯示，共有17 541個(gè)基因集在小鼠耳蝸性聾表型中表達(dá)上調(diào)，有1 836個(gè)基因集在小鼠耳蝸性聾表型中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)前三位上調(diào)的通路包括樹(shù)突細(xì)胞成熟、Croonquist Nras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及反應(yīng)金屬離子硫蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，而前三位下調(diào)的通路包括半乳糖代謝、氧化磷酸化及嘌呤代謝。Someya等[25]研究表明耳蝸性聾與氧化磷酸化相關(guān)。而其他通路仍需要更多的基礎(chǔ)研究來(lái)驗(yàn)證。然而，本研究也有一些不足：首先，樣本量較小，僅包括5個(gè)耳蝸性聾小鼠樣本和5個(gè)對(duì)照組樣本；第二，分析結(jié)果中篩選出的基因及通路超過(guò)半數(shù)未在基礎(chǔ)研究中得到驗(yàn)證，故暫無(wú)足夠文獻(xiàn)供分析，需要更多基礎(chǔ)研究來(lái)進(jìn)一步闡明基因集富集分析的結(jié)果；第三，本研究的結(jié)果全部來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，仍需進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

總之，本研究獲得的小鼠耳蝸性聾差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果，不僅為耳蝸性聾研究方向的擴(kuò)展提供了新思路，對(duì)于其發(fā)病機(jī)制及分子靶向治療的研究也具有較好的提示作用。