擴散加權(quán)成像與光學(xué)成像評價小鼠胃癌移植瘤體內(nèi)動態(tài)變化

孫佳，李曉婷，張來運，楊磊，李竹林

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院放射科，北京 100020；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院放射科，北京 100142； *通訊作者 孫佳xnqiuqiu@163.com

胃癌的病死率居中國惡性腫瘤第2位，其在發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中的生物學(xué)行為體現(xiàn)出癌腫的惡性度及侵襲性，反映了胃癌的本質(zhì)，直接影響胃癌的預(yù)后[1-2]。MRI對軟組織的分辨率高，可為胃癌生物學(xué)行為提供多種評價指標[3]。擴散加權(quán)成像（DWI）更能夠從分子水平反映病變內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，在形態(tài)學(xué)發(fā)生變化前即可通過表觀擴散系數(shù)（ADC）量化水分子擴散的變化[4-6]。生物發(fā)光成像不僅可以定性反映腫瘤細胞的存在，利用光子數(shù)還可以敏感地定量分析瘤體內(nèi)細胞活性的變化[7-9]。DWI-ADC與光字數(shù)均為胃癌生物學(xué)行為變化提供了新的早期評價指標。本研究聯(lián)合 MRI與光學(xué)成像，通過對胃癌小鼠移植瘤進行體內(nèi)動態(tài)觀察，評價胃癌生物學(xué)行為的演變。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞培養(yǎng)與動物模型建立 采用低分化胃腺癌BGC-823細胞株，在RPMI 1640培養(yǎng)基中使用胎牛血清培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（37.0±2.0）℃，pH 7.2，5% CO2。選擇對數(shù)生長期的細胞制成PBS懸液。

雌性Balb/c裸小鼠5只，4～6周齡。將BGC-823細胞懸液200 μl注入小鼠右腋下皮下組織內(nèi)，建立皮下移植瘤模型。

手術(shù)切除1只小鼠皮下瘤，選取腫瘤實性部分切成約1 mm3的組織塊。選取正常雄性Balb/c裸小鼠5只，4～6周齡，取腹部左正中旁切口，將1 mm3組織塊種植于胃前壁肌層，建立胃癌的原位移植瘤模型[10]。

1.2 MRI掃描與分析 荷瘤小鼠均行 GE Discovery MR750 3.0T MR基線掃描，使用8通道高清腕關(guān)節(jié)線圈。T1WI：TR 400 ms，TE 12 ms；T2WI：TR 3381 ms，TE 58 ms。軸位視野（FOV）60 mm×30 mm、冠矢狀位FOV 60 mm×60 mm。DWI-EPI序列（b=0、1000 s/mm2）：TR 2000 ms，TE 75 ms，F(xiàn)OV 80 mm×60 mm。所有序列層厚均為2 mm。T2WI圖像測量腫瘤面積，DWI圖像測量腫瘤ADC值。由2名具有10年工作經(jīng)驗的放射科主治醫(yī)師獨立測量獲得結(jié)果，并取平均值。感興趣區(qū)勾畫避開腫瘤壞死部分。

1.3 生物發(fā)光成像 通過陽離子脂質(zhì)體法對 BGC-823細胞進行轉(zhuǎn)染，至轉(zhuǎn)染效率達95%以上。Xenogen IVIS光學(xué)成像系統(tǒng)，皮下移植瘤小鼠分別于移植后第5、9、13、17、21、25、28天進行光學(xué)成像，原位移植瘤小鼠分別于移植后第7、10、14、21、28、35、42天進行光學(xué)成像。荷瘤小鼠全部進行光學(xué)的基線觀察，排除背景光影響。皮下移植瘤觀察截止于移植后第4周，原位移植瘤觀察截止于移植后第6周。

1.4 病理學(xué)切片染色 將小鼠移植瘤、胃、肝、脾、胰腺、雙腎、小腸、結(jié)腸、后腹膜及腸系膜、雙肺、大腦、小腦、胸椎、腰椎等標本進行HE染色，實質(zhì)性器官間隔0.2 cm進行切割，石蠟包埋，切片厚度4 μm。判斷移植瘤觀察末期腫瘤內(nèi)活性組織、壞死情況、腫瘤對鄰近組織結(jié)構(gòu)的侵襲性及轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié)果

2.1 皮下移植瘤和原位移植瘤的大小、DWI-ADC值及光子計數(shù)動態(tài)變化 MRI皮下移植瘤截面積隨時間不斷增大，皮下移植瘤截面積-時間曲線斜率無明顯變化（圖 1A）；原位移植瘤的面積隨時間不斷增大，第 30天后腫瘤截面積-時間曲線出現(xiàn)平臺（圖1B）。

皮下移植瘤的ADC值先逐漸下降，于第 13天ADC值-時間曲線出現(xiàn)平臺，然后反向上升（圖1C）；原位移植瘤ADC值-時間曲線的變化相似，于第28天腫瘤ADC值出現(xiàn)平臺，繼而反向上升，但轉(zhuǎn)折點的出現(xiàn)早于生物發(fā)光成像（圖1D）。

皮下移植瘤與原位移植瘤的光子數(shù)-時間曲線隨時間增加，光子數(shù)升高后出現(xiàn)下降。皮下移植瘤光子數(shù)-時間曲線的轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)于第17天（圖1E）；而原位移植瘤的轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)于第35天（圖1F）。

2.2 皮下移植瘤和原位移植瘤的生長方式與轉(zhuǎn)移MRI胃癌小鼠皮下移植瘤始終呈膨脹性生長，邊界清楚，無向下浸潤。觀察結(jié)束后切除皮下移植瘤，瘤體均具有完整的包膜，對鄰近組織無浸潤。5枚原位移植瘤早期邊界清晰，接種第28天瘤體與鄰近器官分界欠清，交界面凹凸不平，呈浸潤性生長。觀察結(jié)束切除原位移植瘤，瘤體與周圍器官均粘連嚴重，連同鄰近組織共同切除。各原位移植瘤轉(zhuǎn)移情況見表1。

移植瘤的轉(zhuǎn)移MRI中，結(jié)合軸位、冠狀位、矢狀位，皮下移植瘤與原位移植瘤小鼠均未見轉(zhuǎn)移。在生物發(fā)光成像中，5只皮下移植瘤小鼠與5只原位移植瘤小鼠在移植瘤部位以外均未見發(fā)光。病理切片中，皮下移植瘤小鼠的各部位均未見轉(zhuǎn)移。原位移植瘤小鼠肝、脾、胰腺、食管和結(jié)腸可見受侵，腸系膜及后腹膜內(nèi)可見廣泛脈管癌栓，各小鼠受累情況見表 1。但MRI與光學(xué)成像均未見顯示。

圖1 胃癌皮下移植瘤與原位移植瘤的截面積-時間、ADC值-時間及光子數(shù)-時間曲線。A、C、E為皮下移植瘤；B、D、F為原位移植瘤

表1 原位瘤累及深度及全身受累部位

3 討論

通過動態(tài)觀察得知，皮下移植瘤截面積-時間曲線與光子數(shù)-時間曲線的主要形態(tài)差別在于光子數(shù)曲線存在轉(zhuǎn)折點（約第17天），與既往研究結(jié)果相似[11-12]，光子數(shù)在腫瘤生長早期與腫瘤負荷密切相關(guān)，后期兩者相關(guān)性不再可靠。這是由于生物發(fā)光光學(xué)信息來源于細胞內(nèi)部報告基因，決定了其高度特異性[7,13-14]。因此，光學(xué)信號的強弱可以評價腫瘤內(nèi)活性細胞的變化[7-9]。早期腫瘤增殖活躍，瘤內(nèi)以實質(zhì)細胞為主，光學(xué)信號呈逐漸增強的趨勢，腫瘤繼續(xù)生長，細胞內(nèi)間質(zhì)逐漸增多，出現(xiàn)大量新生血管及纖維，并可見出血，而這些間質(zhì)成分參與構(gòu)成腫瘤的大小并不參與光學(xué)信號的發(fā)出[11]。同時，隨著腫瘤進一步生長，造成血供不足，瘤內(nèi)出現(xiàn)大量壞死，壞死組織并不能發(fā)出光學(xué)信號，以上因素共同導(dǎo)致隨著腫瘤截面積的進一步增大，光學(xué)信號值卻下降[15]。因此，與生物發(fā)光成像相比，MRI的截面積曲線可以更好地反映腫瘤的生長速度。但光子數(shù)的曲線特點卻與ADC值曲線類似，均出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點。但ADC值-時間曲線的轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)得更早（約第9天），且于第13天出現(xiàn)平臺，然后反向上升。ADC值反映了組織內(nèi)水分子的擴散受限程度，由于擴散受限程度越大，ADC值越低，腫瘤生長早期異常增殖明顯，擴散受限逐漸加重，故ADC值逐漸下降。隨著腫瘤進一步生長，細胞質(zhì)水分喪失，細胞間質(zhì)中的膠原、基質(zhì)腫脹、崩解和斷裂均使水分子擴散受限得到緩解，ADC值停止繼續(xù)下降，曲線出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，生長末期細胞核出現(xiàn)濃縮、碎裂和溶解，壞死的細胞和崩解的間質(zhì)融合液化，ADC值反向上升。ADC值-時間曲線轉(zhuǎn)折點的出現(xiàn)早于光子數(shù)-時間曲線，提示腫瘤細胞在徹底失活前（光學(xué)信號消失前），其所處的微環(huán)境可能已經(jīng)發(fā)生變化，ADC值能夠更敏感地反映組織結(jié)構(gòu)的變化，與既往研究結(jié)果相似[16-18]，腫瘤的生長動力曲線并不能很好地反映瘤內(nèi)成分的變化；而ADC值則可以反映細胞的結(jié)構(gòu)改變，是早期預(yù)測腫瘤壞死的敏感指標。DWI信號的變化可以反映病理下不同結(jié)構(gòu)甚至分化程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADC值反映細胞結(jié)構(gòu)變化的敏感性高于反映細胞活性的生物發(fā)光成像。

對于原位移植瘤，后期由于受生長空間限制，腫瘤生長曲線出現(xiàn)平臺，曲線的轉(zhuǎn)折點與原位移植瘤光子數(shù)曲線轉(zhuǎn)折點出現(xiàn)的時間幾乎相同，從而可以判斷第35天原位移植瘤內(nèi)成分出現(xiàn)變化，而這一變化在ADC值-時間曲線中于第28天即可顯示。

T1WI、T2WI觀察原位移植瘤在生長后期（第28天后）出現(xiàn)浸潤性，而皮下移植瘤始終呈膨脹生長。既往研究發(fā)現(xiàn)，適宜的宿主環(huán)境是移植瘤克隆形成的必需條件[19-20]。受局部組織免疫反應(yīng)的影響，皮下移植瘤周圍易形成鼠源性纖維包膜[21]；而原位移植瘤模型由于細胞生長環(huán)境更接近實際情況，更有利于進行腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究[8]。本研究中胃癌原位移植瘤生長方式的變化可以更準確地反映惡性腫瘤的生物學(xué)行為，而MRI能夠反映胃癌生長方式的變化。本實驗中，MRI與光學(xué)成像均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)癌栓長徑約0.1～0.3 mm，且多位于小鼠體內(nèi)較深部，截面內(nèi)腫瘤細胞數(shù)約2×102個，故病灶體積較小、脈管內(nèi)腫瘤細胞數(shù)量過少等因素致使脈管內(nèi)微轉(zhuǎn)移灶很難通過生物發(fā)光成像在體表被探及[22-23]。同時MR的體素大小也限制了轉(zhuǎn)移灶在MRI中的顯示。

由于本研究為腫瘤連續(xù)在體動態(tài)觀察，故僅進行了終點時的影像-病理對照，對于腫瘤生長進程中的病理對照有待進一步展開工作探討。

總之，MRI及光學(xué)成像可以評價胃癌生物學(xué)行為的演變。DWI-ADC與生物發(fā)光成像均可以早期提示腫瘤內(nèi)活性成分的變化，且DWI-ADC的敏感性高于生物發(fā)光成像。