螻蛄化學成分及其抗菌活性

劉年珍， 何雨晴，2， 盧辛甜，2， 趙碧清，2?， 周小江，2?

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208；2.湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心，湖南長沙410208）

螻蛄收載于1980 年版《新疆維吾爾自治區(qū)藥品標準》，為螻蛄科昆蟲螻蛄Gryllotalpa africana Palisot et Beauvois 的干燥蟲體。螻蛄藥用歷史悠久，始載于《呂氏春秋》，稱為螻蟈， 《神農(nóng)本草經(jīng)》 記載“螻蛄味咸性寒，主產(chǎn)難，出肉刺，潰癰腫，下哽噎，解毒，除惡瘡”； 《本草圖經(jīng)》 記載“利大小便，治口瘡立效”；《本草綱目》 記載螻蛄“利大小便，通石淋，治瘰疬，骨鯁”； 《千金方》 記載“塞耳治聾”［1］。螻蛄在臨床上主要用于治療腎炎、大小便不通、水腫、肝硬化腹水癥、尿 潴 留、 泌 尿 系 統(tǒng) 結 石、 癰 腫、 瘰 疬、 惡 瘡等［1-3］。其水提液具有利尿和鎮(zhèn)靜作用［4］。其主要含有蛋白質、氨基酸、脂肪酸、甾醇、生物堿等成分［5-8］。

螻蛄作為動物類中藥，其臨床療效較好，但對其成分研究不多。為了詮釋其作用物質基礎，特對其化學成分及抗菌活性進行研究，從中分離得6 個化合物，所有化合物均為首次從螻蛄中分離得到，其中化合物4～5 為其抗菌活性成分。

1 材料

Bruker DRX-600 MHz 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司，TMS 為內(nèi)標）；高效液相色譜儀（日本島津公司）；Büchi 型旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公 司）； Sephadex LH-20 （美 國 Amersham Biosciences 公司）；Rp-18 反相硅膠（40 ～63 μm，日本Daiso 公司）；D101 大孔吸附樹脂（天津允開公司）；色譜硅膠（200 ～300 目）、硅膠H 和薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）。所用試劑均為分析純。

供試菌株為真菌薯蕷炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，由海南大學熱帶農(nóng)林學院薯蕷課題組提供。

螻蛄藥材購買自湖南振興中藥飲片實業(yè)有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為螻蛄科昆蟲螻蛄Gryllotalpa africana Palisot et Beauvois 的干燥蟲體。標本存放在湖南中醫(yī)藥大學含浦校區(qū)二號實驗樓C 棟427 室。

2 提取與分離

螻蛄藥材10 kg 加6 倍量70%乙醇回流提取3次，1 h／次，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮，得濃縮液。將濃縮液加于已用蒸餾水平衡好的大孔吸附樹脂 （HP-20） 柱上， 分別用30%、50%、70%、90%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，合并70%、90%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，得浸膏約60 g。浸膏拌樣，加于正相硅膠柱色譜柱上，石油醚-乙酸乙酯-甲醇（70 ∶30 ∶0～70 ∶30 ∶35） 梯度洗脫，收集洗脫液，每份約500 mL，檢識，合并成5 部分（Fr.1～Fr.5）。

Fr.3（4.8 g） 過MCI 柱，甲醇-水梯度洗脫，檢識，合并成3 部分 （Fr.3-1 ～Fr.3-3）。Fr.3-2（0.4 g） 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱和高效液相色譜［甲醇-水（78 ∶22） ］，得化合物6 （4.3 mg）。Fr.3-3（1.3 g） 過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，甲醇洗脫，檢識，合并成4 部分（Fr.3-3-1 ～Fr.3-3-4），F(xiàn)r.3-3-1（0.08 g） 經(jīng)高效液相色譜［甲醇-水（59 ∶41） ］， 得化合物3 （2.5 mg）。 Fr.3-3-2（0.14 g） 經(jīng)制備薄層（PTLC） ［三氯甲烷-丙酮（1 ∶5） 為展開劑］ 和高效液相色譜 ［甲醇-水（62 ∶38） ］， 得化合物1 （2.1 mg）。 Fr.3-3-4（0.19 g）經(jīng)制備薄層（PTLC） ［石油醚-乙酸乙酯（10 ∶3） 為展開劑］ 和高效液相色譜［甲醇-水（58 ∶42） ］，得化合物5（4.0 mg）。Fr. 4（7.5 g）過MCI 柱色譜，甲醇-水梯度洗脫，檢識，合并成2 部分（Fr.4-1、Fr.4-2）。Fr.4-2（2.1 g） 先過正相硅膠柱色譜［石油醚-乙酸乙酯梯度（4 ∶1 ～1 ∶2）洗脫］，再經(jīng)高效液相色譜［甲醇-水（76 ∶24） ］，得化合物4（10.2 mg） 和2（3.0 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：紅色固體，易溶于三氯甲烷、甲醇， 硫 酸-乙 醇 顯 黃 色。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.02（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.48（1H，s，H-4），7.22（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），6.91（1H，dd，J=8.7，2.5 Hz，H-7），5.15（1H，d，J=7.7 Hz，H-1′），2.23（3H，s，CH3）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.9（C-9），185.3（C-10），164.9（C-1），163.2（C-6），161.7（C-3），137.3（C-4a），134.1（C-10a），130.9（C-8），125.1（C-8a），124.9（C-7），120.0（C-2），117.9（C-5），112.9（C-9a），106.3（C-4），101.7（C-1′），78.4 （C-5′），78.2 （C-3′），75.0 （C-2′），71.1（C-4′），62.3（C-6′），8.5（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］ 一致，故鑒定為2-甲基-1，6-二羥基蒽醌-3-O-β-葡萄糖苷。

化合物2：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.15（1H，d，J=8.5 Hz，H-8），7.51（1H，d，J=2.6 Hz，H-5），7.22（1H，s，H-4），7.16（1H，dd，J=8.6，2.6 Hz，H-7），2.15（3H，s，CH3）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），184.2（C-10），165.0（C-3），164.3（C-1），163.8（C-6），137.2（C-10a），133.9（C-4a），130.7（C-8），127.0（C-8a），122.3（C-7），119.6（C-2），113.9（C-5），110.6（C-9a），108.2（C-4），8.3（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］ 一致，故鑒定為2-甲基-1，3，6-三羥基蒽醌。

化合物3：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。 1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.98（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.42（1H，s，H-4），7.27（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），6.85（1H，dd，J=8.8，2.5 Hz，H-7），5.39（1H，d，J=7.6 Hz，H-1′），5.37（1H，d，J=2.1 Hz，H-1″），2.22（3H，s，CH3），1.16（3H，d，J=6.2 Hz，rham-CH3）； 13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），185.7（C-10），163.2（C-1），163.1（C-6），161.1 （C-3）， 137.3 （C-4a）， 134.0 （C-10a），131.1（C-8），125.8（C-8a），122.8（C-7），120.8（C-2），112.8（C-5），111.6（C-9a），105.8（C-4），102.5（C-1″），99.6（C-1′），79.7（C-5′），79.3（C-3′），78.2（C-2′），74.1（C-4″），72.5（C-2″），72.2 （C-3″），71.3 （C-4′），70.3 （C-5″），62.9（C-6′），18.4（C-6″），9.3（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］ 一致，故鑒定為2-甲基-1，6-二羥基蒽醌-3-O-β-葡萄糖-（2′→1″） -α-鼠李糖苷。

化合物4：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯紫紅色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.77（1H，s，H-8），8.69（1H，s，H-13），8.11（1H，d，J=9.0 Hz，H-11），7.99（1H，d，J=8.9 Hz，H-12），7.65（1H，s，H-1），6.96（1H，s，H-4），6.11（2H，s，-OCH2O），4.92（2H，t，J=5.4 Hz，H-6），4.20（3H，s，9-OCH3），4.10（3H，s，10-OCH3），3.25（2H，t，J=5.4 Hz，H-5）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：152.3（C-10），152.2（C-3），150.1（C-2），146.5（C-9），145.8（C-8），139.8（C-13a），135.3（C-12a），132.0（C-4a），128.0（C-11）， 124.5 （C-12）， 123.4 （C-8a），122.0（C-13b），121.5 （C-13），109.4 （C-4），106.6（C-1），103.7（-OCH2O），62.6（9-OCH3），57.6（10-OCH3），57.2（C-6），28.2（C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］ 一致，故鑒定為小檗堿。

化合物5：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯紫紅色。 1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.78（1H，s，H-8），8.82（1H，s，H-13），8.13（1H，d，J=9.1 Hz，H-11），8.02（1H，d，J=9.0 Hz，H-12），7.68（1H，s，H-1），7.06（1H，s，H-4），4.91（2H，t，J=5.4 Hz，H-6），4.21（3H，s，9-OCH3），4.12（3H，s，10-OCH3），3.99（3H，s，2-OCH3），3.95（3H，s，3-OCH3）3.31（2H，t，J=5.4 Hz，H-5）； 13C-NMR（150 MHz，CD3OD） δ：154.0（C-3），152.1（C-10），151.1（C-2），146.6（C-8），145.9（C-9），140.0（C-13a），135.4（C-12a），130.2（C-4a），128.2（C-12），124.6（C-11），123.5（C-13b），121.4（C-13），120.6（C-8a），112.3（C-4），110.0（C-1），62.7（9-OCH3），57.7 （10-OCH3）， 57.3 （2-OCH3）， 57.0 （3-OCH3），56.7（C-6），27.8（C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］ 一致，故鑒定為巴馬汀。

化合物6：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.12（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.50（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），7.42（1H，s，H-4），7.18（1H，dd，J=8.7，2.5 Hz，H-7），5.42（1H，d，J=7.6 Hz，H-1′），5.39（1H，d，J=2.1 Hz，H-1″），2.23（3H，s，-COCH3），1.97（3H，s，2-CH3），1.17（3H，d，J=6.2 Hz，H-6″）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），185.6（C-10），181.0（-COCH3），163.2（C-1），161.1（C-6），161.1（C-3），137.3（C-4a），134.0（C-10a），131.1（C-8），131.1（C-8a），122.8（C-7），117.0（C-2），112.8（C-5），112.8（C-9a），105.9（C-4），102.5（C-1″），99.6 （C-1′），79.7 （C-3′），79.3 （C-2′），78.3（C-5′），74.1（C-4″），72.9（C-2″），72.5（C-3″），72.2 （C-4′），71.3 （C-5″），70.3 （C-6′），21.8（-COCH3），18.3（C-6″），9.3（-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］ 一致，故鑒定為2-methyl-1，6-dihydroxy-9，10-anthraquinone-3-O-（6′-O-acetyl） -α-L-rhamnosyl-（1″→2′） -β-D-glucoside。

4 抗菌活性篩選

4.1 方法［13］

4.1.1 抑菌活性 陽性對照品為放線菌酮，空白對照品為色譜甲醇。供試菌株由于低溫（-10 ℃）保存，在活性檢測前需進行活化。制備土豆固體培養(yǎng)基并滅菌制成平板備用，挑取供試菌株菌絲體置于培養(yǎng)基中，于25 ℃無菌室中靜置48 h。制備土豆液體培養(yǎng)基并滅菌置于離心管中備用，挑取已活化的菌絲體置于離心管中，于搖床上（25 ℃，暗處） 振搖24 h。將已制備好的菌液用滅菌棉簽均勻涂板，用鑷子夾取直徑6 mm 的無菌濾紙片放在平板中浸泡。將所得化合物和放線菌酮分別用甲醇溶解并配成1 mg／mL 溶液。各吸取10 μL 置于濾紙上，密封后于25 ℃無菌室中靜置48 h 后觀察。

4.1.2 最小抑菌濃度 采用96 孔板法，將化合物4 ～5 分別配成1 mg／mL 溶液， 吸取640 μL 加360 μL甲醇定容至640 μg／mL，質量濃度依次呈0.5 倍梯度稀釋10 次至1.25 μg／mL，用空白培養(yǎng)基和甲醇溶液作對照，制備土豆液體培養(yǎng)基并滅菌備用。將稀釋好的樣品和對照品分別吸取10 μL 置于已加入10 μL 培養(yǎng)液的96 孔板中。密封后于25 ℃無菌室中靜置48 h 后觀察。

4.2 結果

4.2.1 抑菌活性 實驗結果見圖1。結果表明，化合物4～5 具有一定的抑菌活性。

圖1 抑菌實驗結果Fig.1 Results of bacteriostasis experiment

4.2.2 最小抑菌濃度 結果顯示，化合物5 在640 μg／mL 以下無明顯抑菌活性， 化合物4 在320 μg／mL 以上有一定的抗病原真菌薯蕷炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 活性，化合物4 最小抑菌濃度為320 μg／mL。

5 討論

本研究首次從螻蛄中分離和鑒定了4 種蒽醌類和2 種生物堿類成分，且化合物4 ～5 為抗菌活性成分，這為研究其臨床治療腎炎等的物質基礎奠定了基礎。動物藥主要含有蛋白質等大分子類成分［14-15］，本實驗針對小分子化合物進行研究，并找出具有抗菌活性的小分子化合物，以期豐富動物藥的研究思路。螻蛄為動物藥，本研究從中發(fā)現(xiàn)了蒽醌類和生物堿類成分，并且有小檗堿和巴馬汀，推測這些化合物與其食物來源相關。