魔芋固體飲料微生物項目檢測用稀釋液的選擇及適用性研究

秦磊磊　李素媛　黃龍　江一飛　劉健　羅愛玲

摘要：通過對魔芋膳食纖維微生物項目檢測，用標準稀釋液配方進行優(yōu)化改良，使樣品稀釋后的黏度降低，提高樣品稀釋液流動性，增加樣品稀釋后的均勻性，確保檢測結果的準確性。結果表明，甘油的濃度為30%～40%，NaCl的濃度為0.85%時所組成的稀釋液效果最佳，該樣品稀釋液保持良好流動性的時間能夠較好地滿足試驗需要，使用該稀釋液配方進行相關項目檢測時，具有較好的適用性。

關鍵詞：甘油;魔芋膳食纖維固體飲料;微生物;稀釋液選擇;適用性

中圖分類號：TS207.4? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）11-0107-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.11.027? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

The selection and applicability research on the diluent for konjac solid beverage microbiological item

QIN Lei-lei，LI Su-yuan，HUANG Long，JIANG Yi-fei，LIU Jian，LUO Ai-ling

（Three Gorges Public Inspection and Testing Center，Yichang 443000，Hubei，China）

Abstract： The standard diluent formula of the konjac dietary fiber microbial project was optimized to reduce the viscosity after dilution， improve the fluidity of the sample diluent， increase the uniformity of the sample dilution， ensure the accuracy of the test results. The applicability of the improved diluent was studied through comparative experiments. the diluent consisting of glycerol at the concentration of 30%～40% and NaCl at the concentration of 0.85% had the best effect， and the time of maintaining good fluidity of the diluent could meet the needs of the experiment. The diluent formula had a good applicability in the detection of related items.

Key words： glycerin; konjac dietary fiber solid drinks;microorganism;selection of diluent;applicability

魔芋又名蒟蒻，是天南星科魔芋屬多年生草本植物，中國魔芋種植面積較大[1]。湖北省為中國魔芋重要種植區(qū)，素有中國魔芋看湖北，湖北魔芋看鄂西的說法，是典型的小作物，大產業(yè)。魔芋富含大量的膳食纖維，因其獨特的保健功能被稱為“第七大營養(yǎng)素”[2]，具有良好的調節(jié)腸道、預防心血管疾病、控制體重、防治糖尿病、調節(jié)脂質代謝等功能[3]。魔芋膳食纖維具有良好的親水性、凝膠性，因此作為添加劑在食品工業(yè)中被廣泛使用[4]。魔芋膳食纖維固體飲料因其良好的功能性、沖調性與便利性受廣大人群所喜愛。

固體飲料是即沖即飲型食品，如果微生物超標將會嚴重威脅到人們的身體健康和生命安全[5]，因此對固體飲料產品微生物進行控制至關重要。但是魔芋膳食纖維親水性強、易凝膠，按照國家標準方法對其微生物衛(wèi)生指標進行檢測時，樣品稀釋后快速形成凝膠，稀釋液的均勻性與流動性極差，后續(xù)試驗無法正常操作，不能獲得準確真實的檢測數據，對產品的質量安全控制評估造成了非常大的困難，產品的質量存在一定的安全隱患。通過試驗，添加一定比例的甘油，使魔芋膳食纖維稀釋液在一定時間內保持較好的流動性，從而保證試驗的順利進行，同時確定了稀釋液中甘油的添加比例，并研究了改良后稀釋液的適用性。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

魔芋膳食纖維固體飲料;實驗室自分離菌株1-32，魔芋膳食纖維固體飲料產品中分離;大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.c）CMCC44102，中國醫(yī)學細菌保藏管理中心;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.a）CMCC26003，中國醫(yī)學細菌保藏管理中心;甘油，西隴科技;氯化鈉，西隴科技;平板計數培養(yǎng)基，海博生物;菌落總數質控樣品、大腸菌群質控樣品、金黃色葡萄球菌質控樣品，中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心。

1.2? 設備

LRH-250型生化培養(yǎng)箱，廣東韶關醫(yī)療器械;BXM-50型滅菌鍋，博迅;Bio-ⅡA型生物安全柜;ME2002型電子天平，梅特勒DV2T型黏度計，博勒飛。

1.3? 方法

1.3.1? 黏度測定? 量取500 mL 30 ℃的生理鹽水注入500 mL燒杯中，然后將燒杯放入（30±1） ℃恒溫水浴槽，將攪拌器放入燒杯中開啟攪拌，調整轉速至150 r/min。稱取5.00 g待測樣品，緩緩加入燒杯中，攪拌1 h后停止，取出燒杯，用4號轉子測定，0.5 h重復一次，直至黏度值達到最大值并明顯開始下降[6]。

1.3.2? 改良稀釋液的配制? 分別稱取20、25、30、35、40 g甘油于燒杯中，加0.85%生理鹽水混勻后定容至100 mL，121 ℃、0.1 MPa滅菌15 min，取18 mL于燒杯中，加入2 g高黏度魔芋膳食纖維固體飲料，充分混勻，記錄稀釋液保持良好流動性時間，用不同濃度甘油-生理鹽水稀釋液代替蒸餾水按照“1.3.1”進行魔芋膳食纖維固體飲料黏度測定，同時測定稀釋液黏度。

1.3.3? 菌種的制備? 將實驗室自分離菌株1-32、大腸埃希氏菌CMCC44102、金黃色葡萄球菌CMCC26003分別轉入營養(yǎng)肉湯中[7]，36 ℃培養(yǎng)24 h，待菌種復蘇后營養(yǎng)瓊脂36 ℃培養(yǎng)24 h純化菌落，挑取單個菌落36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取新鮮培養(yǎng)物制備成0.5麥氏濁度菌懸液，并逐級稀釋至菌懸液濃度約為106、105、104、103、102、10 cfu/mL，備用，吸取上述相同濃度菌懸液各1 mL，充分混勻。

1.3.4? 驗證

1）抑制性評價。分別使用25 mL 0%、30%、35%、40%甘油-生理鹽水無菌稀釋液代替樣品，加入225 mL相應甘油濃度稀釋液中，接種1 mL混合菌懸液，每個接種水平做6平行，按照GB4789.2-2016[8]進行菌落計數，檢測結果取對數，以稀釋液中甘油濃度為變量，使用Excel對試驗結果進行方差分析。

2）準確度。稱取25 g滅菌魔芋膳食纖維固體飲料于無菌均質袋中，加入225 mL甘油稀釋液，分別接種1 mL懸液，每個水平2平行[9]，采用GB4789.2-2016進行菌落總數檢測。用25 mL無菌生理鹽水替代樣品加入225 mL無菌生理鹽水稀釋液作為參比對照;使用25 mL無菌甘油-生理鹽水稀釋液替代樣品加入225 mL相應甘油濃度稀釋液作為樣品空白對照。檢測結果取對數，評價改良稀釋液結果與參比對照結果相對誤差。

3）質控樣品試驗。將西林瓶中凍干粉取出，與25 g滅菌膳食纖維固體飲料混勻，使用改良稀釋液沖洗西林瓶內壁，合并沖洗液與剩余稀釋液，將凍干粉與魔芋膳食纖維固體飲料混合物加入混勻，此為樣品原液，按照質控樣品說明書指定方法進行檢測，最終結果轉化為西林瓶中菌落數總量（cfu）=原液菌濃度（cfu/mL）×225（mL）。

2? 結果與分析

2.1? 甘油對稀釋液黏度的影響

由于工藝及產品規(guī)格不同，魔芋膳食纖維中葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）含量不同，魔芋膳食纖維固體飲料黏度存在一定差異，測定6批次魔芋膳食纖維1%生理鹽水溶液黏度，黏度在1 800～37 500 MPa·s（表1）。

KGM含量超過5%時為KGM強凝膠[10]，KGM大分子中含有大量的羥基等親水性基團，通過分子間作用力與水分子相結合[11]，添加一定濃度的甘油后稀釋液極性降低，KGM在甘油中溶解度降低，其主分子鏈未完全展開，沒有溶脹溶解[12]，葡甘聚糖與水分子間相互作用力減弱，形成凝膠時間有所延長。1% KGM 在一定甘油添加量的溶液中黏度顯著下降，因甘油本身具有一定黏性，甘油添加量超過25%后溶液本身黏度略有上升。稀釋液甘油濃度大于30%時，黏度37 500 MPa·s樣品10倍稀釋液保持良好流動性時間達10 min以上，可滿足微生物檢測需要，確定稀釋液配方為每100 mL稀釋液含甘油30～40 g、NaCl 0.85 g（表2）。

2.2? 抑制性評價

用產品中分離芽孢菌、大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌混合菌株污染樣品模擬產品菌相構成，以稀釋液甘油濃度為變量，對不同濃度甘油稀釋液檢測結果進行方差分析，檢測結果以10倍稀釋液為原液計，評估甘油添加量對不同接種水平試驗結果的影響（表3）。表4方差分析顯示，102～105 cfu/g接種水平下，F值分別為1.626、1.507、1.486、0.934，當給定α=0.05時，F0.95（3，20）=3.098，不同接種水平F值均小于F0.95（3，20），表明檢測魔芋膳食纖維固體飲料菌落總數時，不同甘油添加量之間無顯著差異，30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液與生理鹽水稀釋液檢測結果無顯著差異，按照標準流程檢測，適量甘油對產品菌相中芽孢菌、大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用，可用以改良魔芋膳食纖維固體飲料微生物檢測用稀釋液。

甘油通常作為菌種保藏防凍劑使用，方光遠等[13]使用85%甘油-生理鹽水-20 ℃保存枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、雞大腸桿菌，3株菌均保存4年仍有活力;鐘志宏等[14]將8份甘油與2份生理鹽水混勻后用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌等24株菌的冷凍保存。部分微生物可利用甘油作為碳源，甘油對細菌抑制作用較小，在檢測過程中，微生物在甘油稀釋液中接觸時間短，移取30%～35%甘油稀釋液1 mL注入20 mL培養(yǎng)基后培養(yǎng)物中甘油含量僅為0.015～0.020 g/mL，含量極低，經過前期魔芋膳食纖維固體飲料產品菌相分析，產品優(yōu)勢菌為芽孢菌[15]，芽孢菌對環(huán)境有較強的抗性，且產品經過高溫加工水分含量較低，通常以芽孢形式存在，與一定含量甘油短時間內接觸不會被抑制或滅活，方差分析也證明一定濃度甘油稀釋液與生理鹽水稀釋液檢測結果無明顯差異。

2.3? 準確度

分別使用5株來自樣品中分離的優(yōu)勢菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌人工污染樣品，對接種不同水平的樣品分別采用30%、35%、40%甘油-生理鹽水稀釋液進行菌落總數計數，菌落總數以10倍稀釋液為原液計，菌落計數服從泊松分布，對檢測結果取對數轉換為正態(tài)分布數據[16]，檢測結果如表5所示。根據表5可知，接種水平在103～105 cfu/g時，使用不同濃度甘油稀釋液檢測結果與參比對照結果相對誤差僅兩組超過10%，具有較高的準確性，接種水平為102 cfu/g時，42組試驗中14組與參比對照相對誤差超過10%，檢測結果存在較大波動，主要原因是低接種水平微生物分布均勻性較差，樣品的加入也會導致樣品稀釋液終體積及取樣體積有所差異，取樣過程中誤差較大，且存在一定的隨機性。接種水平103～105 cfu/g時，不同甘油濃度稀釋液檢測結果也具有較好的一致性，甘油濃度變化對檢測結果無明顯影響。

樣品空白對照與參比試驗結果相對誤差在103～105 cfu/g接種水平下均小于10%，102 cfu/g接種水平下，42組試驗僅4組相對誤差超過10%，但仍在15%以內（表6）。

2.4? 質控樣品試驗

分別使用30%、35%、40%甘油-生理鹽水稀釋液對質控樣品進行檢測，檢測結果見表7。由表7可知，3個甘油稀釋液測定結果均在特性值區(qū)間范圍內，符合質量控制需求，稀釋液中添加一定量的甘油對質控樣品檢測結果無影響，操作過程中，30%～40%甘油對質控樣品中微生物抑制性影響不大。

3? 結論

稀釋液甘油含量>30%時，可在一定時間內有效改善魔芋膳食纖維固體飲料10倍稀釋液的流動性，提高樣品的均勻性，滿足微生物項目檢測的時間要求。抑制性試驗表明，102～105 cfu/g接種水平下，不同濃度甘油-生理鹽水稀釋液檢測菌落總數結果無顯著差異，采用質控樣品驗證時，實測值均能在特性值區(qū)間，滿足質量控制要求，對比試驗中，接種水平103～105 cfu/g時，30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液檢測結果與參比試驗均有較好的一致性，回收水平較高，102 cfu/g接種水平時，部分試驗組結果與參比試驗結果相對誤差較大，考慮參比對照試驗中未加入魔芋膳食纖維，稀釋液體系存在一定差異，且低菌含量水平下，取樣造成誤差較大，但通過改良稀釋液樣品空白與參比試驗結果，在不添加樣品情況下，低接種水平改良稀釋液樣品空白與參比試驗結果相對誤差明顯降低，說明低接種水平下，主要誤差來源于稀釋液體系的差異，受甘油的影響不大，綜合考慮，30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液在低污染水平下也具有一定的適用性。

30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液均能有效解決稀釋液凝膠速度快的問題，且具有良好的適用性，能夠滿足產品質量控制需求。考慮試驗成本，改良稀釋液配方可為每100 mL稀釋液含甘油30 g、NaCl 0.85 g。由于檢驗人員操作熟練程度不同，不同批次魔芋膳食纖維固體飲料葡甘聚糖含量有一定差異，凝膠速度有所不同，建議在試驗前通過預試驗確定最佳甘油添加比例，40%甘油-生理鹽水稀釋液對凝膠形成的延緩時間基本能夠滿足目前大多數產品檢測需要，但不排除有更高黏度樣品存在，當甘油添加量超過40%時，需重新對改良稀釋液適用性進行評估。

參考文獻：

[1] 黃明發(fā)，張盛林.魔芋膳食纖維保健作用研究進展[J].中國食物與營養(yǎng)，2010（5）：75-77.

[2] 陳? 筠.膳食纖維的保健功能及在食品添加中的應用[J].北京農業(yè)，2012（6）：154-155.

[3] 周? 堅，肖安紅.功能性膳食纖維食品[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005.52.

[4] 鄒新禧，謝美然.魔芋葡甘聚糖的研究進展[J].現代化工， 1992（12）：15-17.

[5] 鄧全道.出口固體飲料的衛(wèi)生質量控制[J].食品科技，2014（1）：50-52.

[6] NY/T 494-2010，魔芋粉[S].

[7] 趙? 暉，李家勇，李? 晶，等.單核細胞增生李斯特菌脂肪酸組分的氣相色譜—質譜分析[J].化學與生物工程，2008，25（11）：68-71.

[8] GB 4789.2—2016，食品安全國家標準? 食品微生物學檢驗菌落總數測定[S].

[9] 李? 宏，雷質文.食品微生物檢測方法確認和證實手冊[M].北京：中國質檢出版社，2013.22-24.

[10] 賀? 攀.魔芋葡甘聚糖的溶膠凝膠機理及應用基礎研究[D].四川綿陽：西南科技大學，2012.

[11] 王莉莉.魔芋葡甘聚糖的提取及其在酸乳中的應用研究[D].合肥：安徽農業(yè)大學，2014.

[12] 馬建龍，戴榮繼，潘? 琳，等.制備方法對魔芋葡甘聚糖溶解速率的影響[J].高分子材料科學與工程，2010，26（11）：52-55.

[13] 方光遠，張志成，晏文梅.幾種不同條件下細菌菌種保存試驗[J].金陵科技學院學報，2004，20（3）：30-32.

[14] 鐘志宏，李啟星，唐小異，等.甘油保存菌種方法的改良[J].實用預防醫(yī)學，2005，12（3）：670-671.

[15] 劉? 健，秦磊磊，李素媛，等.魔芋膳食纖維固體飲料中優(yōu)勢菌的分離、初步鑒定及菌相分析[J].湖北農業(yè)科學，2018，57（14）：60-63.

[16] 國家藥典委員會.中國藥典[M].2015版.北京：中國醫(yī)藥技術出版社，2015.385-387.