基于RAPD標(biāo)記對(duì)71個(gè)柞蠶品種的聚類(lèi)分析

劉丹梅 李文利 王丹丹

摘要：采用隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）的方法，在DNA分子水平上對(duì)我國(guó)不同地區(qū)、不同化性的71個(gè)柞蠶品種進(jìn)行聚類(lèi)分析。從140條RAPD隨機(jī)引物中篩選出28條可穩(wěn)定擴(kuò)增條帶的多態(tài)性引物，共擴(kuò)增出92條多態(tài)性條帶，占總擴(kuò)增帶數(shù)的29%;采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡(jiǎn)稱(chēng)UPGMA）聚類(lèi)法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，構(gòu)建了71個(gè)柞蠶品種的親緣關(guān)系，結(jié)果顯示，各個(gè)地區(qū)與不同化性的柞蠶品種之間親緣關(guān)系沒(méi)有明顯區(qū)別，遺傳類(lèi)型相互混雜。

關(guān)鍵詞：RAPD標(biāo)記;柞蠶;UPGMA;聚類(lèi)分析;親緣關(guān)系

中圖分類(lèi)號(hào)： S885.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0061-05

柞蠶屬于鱗翅目（Lepidoptera）天蠶蛾科（Saturniidae）的絹絲類(lèi)昆蟲(chóng)，我國(guó)境內(nèi)的柞蠶在分類(lèi)學(xué)上屬于柞蠶（Antheraea pernyi），主要分布在10余個(gè)省份。目前保存著上百個(gè)地理種群或生態(tài)類(lèi)型，如山東的客嶺莊種、河南的魯山種、遼寧的璦陽(yáng)種、貴州的湄潭種以及用顏色命名的青皮蠶、黃皮蠶、青黃蠶、銀白蠶、藍(lán)靛蠶等[1]。這些品種都是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工選擇培育以及自然突變逐漸形成的具有不同生理、遺傳特性和區(qū)域適應(yīng)性的柞蠶品種，其經(jīng)濟(jì)性狀各具特征[2]。

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，可以通過(guò)DNA大分子本身來(lái)分析遺傳差異，為物種的起源、親緣關(guān)系和進(jìn)化研究開(kāi)辟了一個(gè)新的途徑。這些研究所提供的大量客觀(guān)的分子水平上的信息，非常有力地推動(dòng)了物種起源、親緣關(guān)系和進(jìn)化的研究。20世紀(jì)90年代發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)，特別是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)RAPD）、選擇性擴(kuò)增DNA片段（selective amplification DNA fragments，簡(jiǎn)稱(chēng)SADF）等技術(shù)[3-7]，以其快速方便的特點(diǎn)，在核酸分子水平上為物種的多態(tài)性提供了豐富的信息，從而被廣泛應(yīng)用于物種遺傳變異、進(jìn)化和親緣關(guān)系等研究領(lǐng)域。這些技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)揭示了許多物種種內(nèi)或種間的遺傳進(jìn)化與親緣關(guān)系，如亞洲玉米螟地理種群分化的研究[8]、蚱屬種間親緣關(guān)系研究[9]、我國(guó)野桑蠶和家蠶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究等[10]。目前已利用這些標(biāo)記技術(shù)成功地構(gòu)建了家蠶的連鎖圖[11-14]。在柞蠶上，此方面的研究也已經(jīng)開(kāi)展起來(lái)[15]，劉彥群等利用RAPD標(biāo)記分析4種體色柞蠶品種的遺傳關(guān)系，表明品種的遺傳聚類(lèi)劃分與體色之間的相關(guān)性不大，柞蠶體色并不能真實(shí)反映品種間的遺傳關(guān)系[16];靳向東等作了廣適性大型多絲量柞蠶新品種選育報(bào)告，將柞蠶品種資源研究運(yùn)用于新品種選育中，育成2個(gè)多絲量柞蠶新品種[17]。在技術(shù)上，RAPD技術(shù)已被應(yīng)用在多種動(dòng)植物上，如農(nóng)志歡等在十大功勞屬6個(gè)種上[18]、李言等在海帶上[19]、石洪玥等在中華絨螯蟹上[20]、陳德西等在蝗蟲(chóng)上[21]都利用RAPD技術(shù)開(kāi)展了種質(zhì)資源的研究。目前，國(guó)內(nèi)的研究主要集中在家蠶、玉米、水稻等生物的種質(zhì)資源方面，有關(guān)柞蠶種質(zhì)資源遺傳進(jìn)化、分類(lèi)以及親緣關(guān)系的研究在深度和廣度上有待完善。因此，本研究采用RAPD技術(shù)對(duì)71個(gè)柞蠶品種的分類(lèi)和親緣關(guān)系進(jìn)行了聚類(lèi)分析，以確立品種間的親緣關(guān)系，以期對(duì)我國(guó)這一特有生物資源開(kāi)展進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

收集我國(guó)遼寧、河南、吉林、山東與內(nèi)蒙古等地的不同地理種群和不同化性的柞蠶品種（表1）[22-26]。本研究在大連理工大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

參照美國(guó)Operon公司設(shè)計(jì)的含有10個(gè)寡核苷酸隨機(jī)引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。RAPD反應(yīng)系統(tǒng)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物工程有限公司。Protease K（蛋白酶K）、RNaseA購(gòu)自美國(guó)Promega公司，瓊脂糖為西班牙產(chǎn)，其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 柞蠶基因組DNA的提取 取液氮中冷凍的單個(gè)柞蠶蛹組織0.5 g研磨[27]，加入2 mL提取緩沖液[10 mmol/L 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）-HCl pH值8.0，0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.5% 十二烷基硫酸鈉（SDS），50 μg/mL 蛋白酶K]，在50～60 ℃保溫3 h[28-31]。加入等體積的酚混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min;取上層液加入等體積的酚/三氯甲烷抽提1次。最后用2/3體積的異丙醇沉淀，用75%乙醇洗沉淀1次。溶于400 μL TE中，加RNase于37 ℃消化30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RAPD反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序 參照Williams等的方法[3]對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增具有影響的反應(yīng)參數(shù)， 如鎂離子、引物、模板濃度、dNTP和Taq酶用量等進(jìn)行優(yōu)化[32-34]。25 μL反應(yīng)液中，含2 U Taq酶、2.5 μL 10×緩沖液（1.5 mmol/L MgCl2+10 mmol/L Tris-HCl+50 mmol/L KCl+0.01%明膠）、dNTP（各200 umol/L）和Primer（10 pmol/L）各1.0 μL、DNA模板1.0 μL（100 ng）。反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，37 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min。

1.2.3 RAPD多態(tài)性分析 每個(gè)柞蠶品種取6個(gè)個(gè)體，分別提取DNA后混合作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%瓊脂糖凝膠中恒壓電泳2 h，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色后在紫外分析儀下觀(guān)察拍照，選取重復(fù)性好且亮度較強(qiáng)的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[35]。在電泳圖譜上同一RAPD位點(diǎn)上有電泳帶者記為1，無(wú)電泳帶者記為0。根據(jù)Nei的公式：I=2NXY/（NX+NY）[36]，計(jì)算出任意2個(gè)個(gè)體（群體或物種）間的遺傳距離D和遺傳相似系數(shù)I。式中：NXY為兩者共同擁有譜帶（RAPD標(biāo)記）的數(shù)目;NX和NY分別為X和Y個(gè)體（或群體、物種）各自擁有的全部譜帶數(shù)。遺傳距離的計(jì)算和系統(tǒng)聚類(lèi)采用NTSYS-PC 2.10e[37]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及PCR擴(kuò)增

采用已經(jīng)確定的反應(yīng)體系和條件，以小黃皮、魯黃、寬青和抗病2號(hào)的DNA作為模板，對(duì)7組共140條隨機(jī)引物進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，結(jié)果共篩選出有效引物60條，再?gòu)闹泻Y選出較好的引物28條（表2）。對(duì)71個(gè)柞蠶品種的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共得到92條清晰的具有多態(tài)性的譜帶，占總帶數(shù)的29%，片段大小介于500～3 000 bp間，平均每條引物可擴(kuò)增3條具有多態(tài)性的譜帶。多態(tài)性譜帶最多的引物為OPM10（5條），最少的為OPG3（2條）?？梢?jiàn)不同引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均有顯著差異，其中引物OPH19的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。此外，不同品種擴(kuò)增的具有多態(tài)性的帶數(shù)亦不相同，其中多態(tài)性譜帶最多的品種為印度柞蠶，共有35條，最少的為青6號(hào)，只獲得16條。

2.2 柞蠶品種間的親緣關(guān)系分析

將每個(gè)DNA片段看作1個(gè)可區(qū)分的RAPD標(biāo)記，根據(jù)Nei的公式[36]計(jì)算出71份柞蠶品種間的遺傳相似系數(shù)（I）和遺傳距離（D）。結(jié)果顯示：2個(gè)河南一化性品種731與云白的相似系數(shù)最高，達(dá)到0.886 7，可見(jiàn)兩者間的遺傳背景比較接近;二化品種黃安東與一化品種豫5號(hào)的相似系數(shù)為 0.867 1，表明兩者之間也有較近的親緣關(guān)系。一化性品種河41同白一化、豫早1號(hào)同201、豫早2號(hào)同魯松、魯黃同松黃等4對(duì)品種的相似系數(shù)都在0.785 7以上，表明這些品種間的親緣關(guān)系較近。而河41、白一化與其他河南一化性品種的相似系數(shù)均低于0.486 2，表明這2個(gè)品種與其他一化性品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

用非加權(quán)組平均法（UPGMA）對(duì)不同化性和不同地理區(qū)域的71個(gè)柞蠶品種根據(jù)遺傳距離（D）進(jìn)行聚類(lèi)分析。由圖2可以看出，大部分的河南一化品種分布在不同的類(lèi)群中，并且在各個(gè)類(lèi)群中首先聚到一起。但是，也有不同地區(qū)與化性的品種能夠較早地聚在一起，如黃安東與豫5號(hào)，它們僅次于河南一化性品種731與云白，第2次就聚在一起。圖2還說(shuō)明，各個(gè)地區(qū)與不同化性的柞蠶品種之間親緣關(guān)系沒(méi)有明顯區(qū)別，遺傳類(lèi)型相互混雜。

2.3 不同地區(qū)柞蠶種群的DNA多態(tài)性聚類(lèi)分析

為了進(jìn)一步揭示不同地理區(qū)域間柞蠶品種的遺傳進(jìn)化關(guān)系，根據(jù)每個(gè)柞蠶品種的最初來(lái)源，選擇具有代表性的、背景清楚的品種作為該地區(qū)的代表性品種（表3）。

將表2中來(lái)自同一個(gè)地區(qū)的所有代表性品種的標(biāo)記作為該地區(qū)種群的RAPD標(biāo)記，進(jìn)行不同地區(qū)柞蠶種群的遺傳距

離（D）分析（表4）。

利用表3數(shù)據(jù)，用UPGMA法構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖。從圖3可以看出，來(lái)自河南地區(qū)的種群與遼寧地區(qū)的種群首先聚類(lèi)到一起， 兩者之間的遺傳距離只有0.066 3。山東與遼寧、山東與河南種群的遺傳距離分別為0.104 2、0.126 1。除了四川與湖北、四川與印度的遺傳距離分別為0.693 1、0.665 0（>0.5）外，其他地區(qū)之間的遺傳距離都<0.5。

3 結(jié)論與討論

柞蠶為鱗翅目（Lepidoptera）天蠶蛾科（Saturniidae）的絹絲類(lèi)昆蟲(chóng)，已記載的共有35個(gè)種，其中31個(gè)種分布在印沃區(qū)，3個(gè)在古北區(qū)，1個(gè)在北美區(qū)。為人們所熟知并用于商業(yè)性生產(chǎn)的有中國(guó)柞蠶（Antheraea pernyi）、2種印度柞蠶（Antheraea assamensis和Antheraea mylitta）和日本天蠶（Antheraea yamamai）。

我國(guó)現(xiàn)存130多個(gè)品種都是中國(guó)柞蠶的變種和地理種或生態(tài)型。各個(gè)品種之間的血緣關(guān)系非常復(fù)雜，各個(gè)品種之間既有高度變異的一面，又有親緣很近的一面。劉彥群等通過(guò)對(duì)河41、四青、青黃1號(hào)和杏黃4個(gè)品種的研究發(fā)現(xiàn)，在DNA水平上的分類(lèi)并沒(méi)有按體色進(jìn)行[38]，對(duì)現(xiàn)行的體色分類(lèi)系統(tǒng)提出了質(zhì)疑。

本研究表明，不同的品種，即使分布相距很遠(yuǎn)，有的竟表現(xiàn)出驚人的相似性和緊密的親緣關(guān)系;而同一個(gè)品種的不同生態(tài)型，有的卻相差懸殊。如在對(duì)71個(gè)柞蠶品種進(jìn)行RAPD多態(tài)性聚類(lèi)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)系統(tǒng)聚類(lèi)圖分為2支，每個(gè)分支中各地區(qū)的品種相互摻雜。但是在第一集團(tuán)的40個(gè)品種中，一化性品種有15個(gè)，占37.5%;在第二集團(tuán)31個(gè)品種中，一化性品種只有8個(gè)，占25.8%。從整個(gè)系統(tǒng)聚類(lèi)圖上可以看出，大部分的一化品種分布在不同的類(lèi)群中，并且在各個(gè)類(lèi)群中首先分別聚到一起。河南的一化性品種731與云白的相似系數(shù)最高，達(dá)到了0.886 7，可見(jiàn)兩者間的遺傳背景非常接近;一化性品種河41同白一化、豫早1號(hào)同201、豫早2號(hào)同魯

松、魯黃同松黃4對(duì)品種的相似系數(shù)也都在0.785 7以上，表明這些品種間的親緣關(guān)系較近。但是，也有不同地區(qū)與化性的品種能夠較早地聚在一起，如黃安東與豫5號(hào)，它們僅次于2個(gè)河南一化性品種731與云白，相似系數(shù)為0.867 1。

有關(guān)柞蠶的分布與分化，印度學(xué)者喬利認(rèn)為，生長(zhǎng)在熱帶的印度柞蠶（A.assamensis）是柞蠶的原始類(lèi)型，其他品種都起源于它，我國(guó)境內(nèi)的柞蠶是由印度東北向我國(guó)南部傳播的[39]。本研究結(jié)果表明，遼寧地區(qū)的品種首先與河南地區(qū)的品種聚在一起，然后又與山東地區(qū)的品種聚在一起。以0.728 1為分界，除了貴州以外，包括朝鮮在內(nèi)的長(zhǎng)江以北的地區(qū)品種首先聚類(lèi)在一起，這一集團(tuán)中包括我國(guó)2個(gè)古代柞蠶傳播中心——山東和河南與現(xiàn)代柞蠶的傳播中心遼寧。印度柞蠶最早從整個(gè)系統(tǒng)中分離出來(lái)，然后是四川、湖北。雖然在古文獻(xiàn)中沒(méi)有找到有關(guān)這些地區(qū)柞蠶品種起源的記載，但是從系統(tǒng)聚類(lèi)圖中可以推測(cè)，在遠(yuǎn)古的時(shí)候柞蠶由印度傳到我國(guó)后，由四川經(jīng)湖北向長(zhǎng)江以北地區(qū)傳播，到達(dá)我國(guó)古代柞蠶傳播中心山東、河南與現(xiàn)代柞蠶的傳播中心遼寧。然后又從這些地區(qū)向吉林、貴州以及朝鮮等地傳播，所以發(fā)現(xiàn)吉林、貴州以及朝鮮的品種又從這些品種中分化出來(lái)。在最后剩下的遼寧、河南、山東的品種中，遼寧與河南分化得最晚;長(zhǎng)江以北的地區(qū)品種的分化情況基本上與歷史資料的記載相吻合[1]。

現(xiàn)代遺傳學(xué)的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為物種的遺傳性狀是由基因決定的，各種外部形態(tài)及內(nèi)部性狀的變異都是由于基因中DNA分子堿基序列發(fā)生改變。本研究在分子水平上對(duì)我國(guó)柞蠶品種資源的遺傳分化和親緣關(guān)系進(jìn)行了探討，可能與已有的研究不完全相符，期望有助于對(duì)我國(guó)這一特有生物資源的保護(hù)和深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所. 中國(guó)柞蠶品種志[M]. 沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[2]郭奕生，陸 俊. 微衛(wèi)星標(biāo)記在雜交稻種子純度鑒定上的應(yīng)用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，41（16）：138-141.

[3]Williams J G，Kubelik A R，Livak K J，et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.

[4]Welsh J，McClelland M. Fingerprinting genomes using arbitraryprimers[J]. Nucleic Acids Research，1990，18（24）：7213-7218.

[5]van der Voort J R，Wolters P，F(xiàn)olkertsma R，et al.Mapping of the cyst nematode resistance locus Gpa2 in potato using a strategy based on co migrating AFLP markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，95（5/6）：874-880.

[6]Keim P，Schupp J M，Travis S E，et al. A high-density soybean genetic map based on AFLP markers[J]. Crop Science，1997，37（2）：537-543.

[7]陳 洪，王振山，朱立煌. SRFA法構(gòu)建水稻DNA指紋圖譜[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，1996，12（3）：266-269.

[8]孫 姍，徐茂磊，王戎疆，等. RAPD方法用于亞洲玉米螟地理種群分化的研究[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2000，43（1）：103-106.

[9]蔣國(guó)芳，陸 敢，黃 琨，等. 用RAPD標(biāo)記研究蚱屬五個(gè)種間的親緣關(guān)系[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2002，45（4）：499-502.

[10]魯 成，余紅仕，向仲懷. 基于RAPD分析的中國(guó)野桑蠶和家蠶遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2002，45（2）：198-203.

[11]夏慶友，周澤揚(yáng)，魯 成，等. 家蠶不同地理品種分子系統(tǒng)學(xué)研究[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，1998，41（1）：32.

[12]李 斌，魯 成，周澤揚(yáng)，等. RAPD標(biāo)記構(gòu)建家蠶分子連鎖圖[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，2000，27（2）：127-132.

[13]何寧佳，魯 成，李 斌，等. 結(jié)合SADF與RAPD標(biāo)記構(gòu)建家蠶連鎖圖[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2001，44（4）：476-482.

[14]朱玉芳，譚遠(yuǎn)德，萬(wàn)春玲，等. 家蠶AFLP連鎖框架圖譜的構(gòu)建[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2001，44（4）：483-493.

[15]桂慕燕，左正宏，王學(xué)民，等. RAPD分析在絹絲昆蟲(chóng)親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用Ⅱ.柞蠶品種間的遺傳差異[J]. 遺傳，2001，23（5）：452-454.

[16]劉彥群，魯 成，向仲懷. 4種體色柞蠶品種遺傳關(guān)系的RAPD分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2006，32（1）：20-24.

[17]靳向東，朱興友，任曉義，等. 廣適性大型多絲量柞蠶新品種選育報(bào)告[J]. 北方蠶業(yè)，2016，37（1）：1-6.

[18]農(nóng)志歡，張啟偉，楊 平，等. 十大功勞屬6個(gè)種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系RAPD分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，47（7）：1077-1082.

[19]李 言，劉延嶺，崔翠菊，等. 海帶種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（4）：151-158.

[20]石洪玥，劉 陽(yáng)，王曉梅，等. 七里海中華絨螯蟹遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2016，35（3）：252-260.

[21]陳德西，封傳紅，何忠全，等. 四川省甘孜州9個(gè)不同地理蝗蟲(chóng)種群遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，29（6）：1336-1342.

[22]宋娜娜，柴志欣，何世明，等. 三江黃牛RAPD遺傳多樣性研究[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2016，48（6）：30-35.

[23]Imazio S，Labra M，Grassi F，et al. Chloroplast microsatellites to investigate the origin of grapevine[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2006，53（5）：1003-1011.

[24]王夢(mèng)亮，任曉琳，崔晉龍，等. 野生紅景天的RAPD和ISSR遺傳多樣性分析[J]. 中草藥，2016，47（3）：469-473.

[25]宋憲軍，聶 磊，張 濤，等. 柞蠶部分品種及雜交種的RAPD分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（4）：428-431.

[26]趙菲佚，焦成瑾，李志明，等. RAPD法鑒定紫花苜蓿品種的條件優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（1）：1-5.

[27]曹蘭娟，楊寶山，李 俊，等. 不同地區(qū)栗蠶（Dictyoploca japonica）的RAPD的分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2007，33（2）：293-296.

[28]Wang X L，Wang X L，Chang C R. RAPD analysis of Rosa laevigata Michx. from different origins[J]. Agricultural Biotechnology，2015，4（5）：33-36.

[29]王 卓，曹蘭娟，劉振林，等. 不同地區(qū)及不同季節(jié)的柞蠶寄生蠅RAPD分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2008，34（2）：354-358.

[30]王小武，付 開(kāi)，丁新華，等. 基于RAPD標(biāo)記的新疆荒漠稻區(qū)稻水象甲遺傳多樣性分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，53（11）：2069-2076.

[31]王鳳成，劉丹梅，仝振祥，等. 用RAPD標(biāo)記分析部分柞蠶二化性品種資源的遺傳多樣性[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2009，35（1）：148-153.

[32]郭曉麗，白麗榮. 10個(gè)小黑麥品種（系）的遺傳多樣性分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45（2）：26-28.

[33]程道軍，魯 成，周澤揚(yáng)，等. 幾種絹絲昆蟲(chóng)遺傳多樣性的RAPD研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2002，28（4）：277-282.

[34]Gui M Y，Zuo Z H，Wang X M，et al. Application of RAPD technique in genetic relationship of silk insect. Ⅱ.Genetic variance in Antheraea pernyi[J]. Heredity，2001，23（5）：452-454.

[35]鐘伯雄，張金衛(wèi)，丁 農(nóng)，等. RAPD技術(shù)在家蠶雜交率檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2003，29（3）：321-324.

[36]Nei M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J]. Genetics，1978，89（3）：583-590.

[37]陳瑩玉，袁思思，吳春蘭，等. 廣西金秀野生茶遺傳多樣性及分子指紋圖譜研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（3）：21-28.

[38]劉彥群，魯 成，向仲懷. 中國(guó)柞蠶DNA多態(tài)性的RAPD分析[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，2002，28（4）：283-288.

[39]喬利MS，林華生. 柞蠶屬種的分布與分化[J]. 國(guó)外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè)，1983（4）：3-9.