測(cè)定生物體內(nèi)Cu2+的熒光探針構(gòu)建及應(yīng)用研究

李小露,楊麗麗,任 帆,吳少平

(1.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/糖生物學(xué)及藥物化學(xué)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 陜西 西安 710069)

重金屬離子含量過多或過少都會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生較大的影響,而重金屬銅在生物體內(nèi)的許多生理過程中起著尤為重要的作用。人體內(nèi)保持最佳的銅離子水平對(duì)平衡新陳代謝和保持人體健康至關(guān)重要。另外,由于金屬銅被廣泛的應(yīng)用工業(yè)生產(chǎn)中,作為一種重要的環(huán)境污染物,工業(yè)廢銅的排放也會(huì)對(duì)環(huán)境造成了很大的污染和危害[1-4]。

阿爾茨海默病 (Alzheimer′s disease, AD) 又稱老年癡呆癥,是一種原發(fā)性神經(jīng)退行性腦病。目前普遍認(rèn)為金屬離子與AD有著密切的關(guān)系。金屬離子諸如Cu2+一方面可以誘導(dǎo)β-淀粉樣蛋白 (Αβ) 發(fā)生聚集,形成淀粉斑導(dǎo)致癡呆;另一方面具有氧化還原活性的金屬離子如Cu2+與Αβ相互作用,可能會(huì)產(chǎn)生活性氧 (ROS) 而引起氧化應(yīng)激,造成神經(jīng)元功能喪失,最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[5-8]。因此,設(shè)計(jì)高靈敏度、高選擇性、原位檢測(cè)銅離子的方法在生命科學(xué)中具有重要意義。

近年來,熒光檢測(cè)技術(shù)在生命科學(xué)和環(huán)境化學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用[9-11],因此,開發(fā)一種可靠,靈敏的探針,可用于有效監(jiān)測(cè)銅生物系統(tǒng)的濃度波動(dòng)是一項(xiàng)有吸引力和緊迫的任務(wù)。傳統(tǒng)檢測(cè)痕量銅的方法有電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP),伏安法和原子吸收光譜法可等[12-16]。然而,這些方法存在一些缺點(diǎn),包括復(fù)雜的樣品處理過程和昂貴設(shè)備的需求,不能用于生理環(huán)境中銅的實(shí)時(shí)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。熒光探針由于其選擇性,靈敏性,非破壞性和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)質(zhì)量而被認(rèn)為是最有力的工具[17]。

本論文設(shè)計(jì)了以羅丹明B為骨架,在羅丹明B骨架上引入噻吩雜環(huán)來合成新型的用來特異性的測(cè)定Cu2+的熒光探針。該探針上的噻吩雜環(huán)與Cu2+絡(luò)合導(dǎo)致羅丹明B開環(huán),在540 nm處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)的發(fā)射峰,表現(xiàn)出強(qiáng)的熒光信號(hào),從而在V(CH3CN)∶V(HEPES)=1∶1(pH=7.4) 緩沖溶液中實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅離子的高靈敏高選擇性熒光檢測(cè),對(duì)探針熒光性質(zhì)進(jìn)行了研究,探針在1～10 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,最低檢測(cè)限為0.32 μmol/L。另外,由于該探針具有高選擇性、高靈敏性和低毒性的特點(diǎn),可以對(duì)生物體內(nèi)的Cu2+進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)(F-7000,日立高新技術(shù)公司),紫外可見分光(UV-2550,日本島津)日本島津,超導(dǎo)核磁共振儀 (6001541ASP,VARIAN公司),電離飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMass Spectrometer),激光共聚焦顯微鏡(OlympusFV-1000,日本Olympus公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000A,上海亞榮生化儀器廠),循環(huán)水式多用真空泵(SHZSHZ-D(III,鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司),三用紫外分析儀(ZF-C型,上海康禾光電儀器有限公司)電子天平(BSA124S,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.2 探針BOTC及其參比的合成

1.2.1 化合物RBH (2a) 的合成 將羅丹明B(4.780 0 g)溶解在乙醇溶液(50 mL)中,在30分鐘內(nèi)緩慢滴加水合肼溶液(8 mL)。然后將反應(yīng)混合物在85℃ 回流4h,直至溶液的熒光消失。反應(yīng)溶液在室溫下冷卻并用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取,有機(jī)相用無水Na2SO4干燥,過濾,旋干,粗產(chǎn)物通過硅膠柱V(DCM)∶V(EtOH)=40∶1純化得到RBH (2a)。Rf:0.61(V(DCM)∶V(EtOH)=20∶1)。收率:95.7 %。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ7.94 (s, 2H), 7.52 (dd,J=11.4, 5.7 Hz, 1H), 7.49～7.44 (m, 2H), 7.33 (d,J=3.3 Hz, 1H), 7.14 (d,J=7.0 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.66 (s, 2H), 6.35 (s, 2H), 6.27 (s, 2H), 3.32 (dd,J=14.3, 7.0 Hz, 8H), 1.15 (t,J=7.0 Hz, 12H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3)δ176.07, 163.80, 161.51, 158.82, 142.46, 139.98, 138.03, 133.78, 132.92, 117.98, 114.52,107.93, 87.31, 87.10,

圖1 探針BOTC及其參比的合成Fig.1 Schemel the synthesis of probe and reference

86.89,75.86, 54.33, 22.58。

1.2.2 探針BOTC (3a) 的合成 RBH(200.0 mg),NaH(52.8 mg),DMAP(26.8 mg)溶于無水乙腈(10 mL)中,然后加入2-噻吩甲酰氯(141 μL),回流2 h。反應(yīng)結(jié)束后,過濾,將紅色溶液旋干,殘?jiān)肈CM稀釋并萃取(3×30mL),有機(jī)層用無水Na2SO4干燥,過濾,旋干,粗產(chǎn)物通過硅膠柱V(PE)∶V(EtOAc)=4∶1純化得到探針BOTC (3a)。Rf:0.44V(PE)∶V(EtOAc)=1∶1。收率:64.6%。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ7.94 (s, 2H), 7.52 (dd,J=11.4, 5.7 Hz, 1H), 7.49-7.44 (m, 2H), 7.33 (d,J=3.3 Hz, 1H), 7.14 (d,J=7.0 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.66 (s, 2H), 6.35 (s, 2H), 6.27 (s, 2H), 3.32 (dd,J=14.3, 7.0 Hz, 8H), 1.15 (t,J=7.0 Hz, 12H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3)δ153.87, 149.04, 130.82, 129.50, 129.35, 128.27, 123.70, 108.06, 104.35, 97.84, 44.42, 12.74。HRMS (C33H34N4O3S): calcd. for [M+H]+567.2430; found: [M+H]+567.2432。

1.2.3 化合物2b的合成 將羅丹明B(2.500 0 g)溶解在乙醇(50 mL)中,加入乙二胺(6.7 mL),混合物在85 ℃下回流20 h。旋干溶劑得到粗品,用CH3CN重結(jié)晶得到化合物2b。Rf:0.47V(DCM)∶V(MeOH)=10∶1。產(chǎn)率:87.3%。

1.2.4 對(duì)照化合物3b的合成 化合物2b(100.0 mg),NaH(25.2 mg),DMAP(13.4 mg)溶于無水乙腈(5 mL)中,然后將2-噻吩甲酰氯(67.4 μL)加入該混合溶液中,回流2 h。反應(yīng)結(jié)束后,過濾,將紅色濾液真空濃縮,殘?jiān)肈CM稀釋并萃取(3×30 mL),有機(jī)層用無水Na2SO4干燥,過濾,旋干,粗產(chǎn)物通過硅膠柱(洗脫液:V(DCM)∶V(MeOH)=40∶1)分離純化得到對(duì)照化合物3b。Rf:0.78V(DCM)∶V(MeOH)=20∶1。收率:79.0 %。HRMS (C35H38N4O3S): calcd. for [M+H]+595.274 3; found: [M+H]+595.275 3。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

探針BOTC標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mmol/L)的制備:準(zhǔn)確稱取探針BOTC 14.2 mg,用無水乙醇溶解并定容到25 mL容量瓶中,即得,將其存放在4℃冰箱中備用。

對(duì)照3b標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mmol/L)的制備:準(zhǔn)確稱取對(duì)照化合物3b 14.9 mg,用無水乙醇溶解并定容到25 mL容量瓶中,即得,將其存放在4℃冰箱中備用。

HEPES緩沖溶液(0.1 mol/L, pH 7.4)的制備:準(zhǔn)確稱取4-羥乙基哌嗪乙磺酸2.380 0 g,將其溶于80 mL蒸餾水中,用20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4,然后用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中,即得。

Cu2+溶液的制備:準(zhǔn)確稱取Cu(NO3)2H2O 18.8 mg, 用V(EtOH)∶V(H2O)=1∶1溶解定容到100 mL容量瓶中,即得,將其存放在4℃冰箱中備用。

1.4 熒光光譜的測(cè)定

在比色管中加入50 μL探針BOTC(1.0 mmol/L),1 mL CH3CN,1.5 mL的Hepes緩沖溶液(0.1 mol/L,pH=7.4)以及不同濃度的待測(cè)離子溶液(100 μL),用蒸餾水將反應(yīng)體系定容至5 mL后掃描該體系的熒光光譜及紫外吸收光譜。

1.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

CCK-8法檢測(cè)探針BOTC對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在96孔板中加入100 μL的細(xì)胞懸液(每孔約1×105個(gè)細(xì)胞),將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2),加入10 μL不同濃度(0，5，10，15，20和25 μmol/L)的探針BOTC溶液,接著在培養(yǎng)箱孵育24 h后向每孔加入10 μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,以免影響OD值的讀數(shù))。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的吸光度。

1.6 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

在直徑20 mm的共聚焦專用皿中加入 1 mL的細(xì)胞懸液,在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2)。加入10 μmol/L的探針BOTC孵育10 min,加入20 μmol/L Cu2+溶液共孵育10 min,然后用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛溶液固定,最后在共聚焦顯微鏡下成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針BOTC的光譜性質(zhì)

首先,我們測(cè)定了探針BOTC與Cu2+反應(yīng)的熒光光譜和吸收光譜(圖2),游離的探針是無色的,當(dāng)加入Cu2+后,日光燈下呈紅色,紫外燈下可以看到產(chǎn)生橙色熒光(圖3)。

圖2 探針BOTC與Cu2+反應(yīng)的吸收和熒光光譜Fig.2 UV-vis absorption (a) and emission spectra (b) of probe BOTC in the absence and presence of Cu2+

圖3 探針BOTC顏色變化Fig.3 Image of color change of probe after the addition of different metal ions

研究了不同濃度的Cu2+對(duì)探針BOTC吸收光譜的影響(圖4)。可以看出,探針本身在555 nm處有強(qiáng)的紫外吸收,隨著Cu2+濃度的增加(1～40 μmol/L),體系的紫外吸收強(qiáng)度逐漸降低,然后慢慢趨于穩(wěn)定,體系的吸收強(qiáng)度在1～16 μmol/L的范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系,R2=0.995 3,檢出限為0.32 μmol/L。接下來又研究了不同濃度的Cu2+對(duì)探針BOTC熒光光譜的影響(圖5),在激發(fā)波長(zhǎng)為540 nm下,探針本身在580 nm處沒有熒光響應(yīng),當(dāng)加入不同濃度的Cu2+(1～40 μmol/L)之后,隨著Cu2+濃度的增加熒光響應(yīng)逐漸增強(qiáng)并慢慢趨于穩(wěn)定。體系的熒光響應(yīng)與Cu2+濃度在1～10 μmol/L范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系,R2=0.997 2。

2.2 動(dòng)力學(xué)研究

為了確定探針BOTC與Cu2+之間的反應(yīng)速率,我們研究了該反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)情況(圖6)?？梢杂^察到,游離探針的熒光信號(hào)隨著時(shí)間的變化幾乎保持不變,當(dāng)加入Cu2+后,反應(yīng)體系熒光信號(hào)迅速增強(qiáng),隨后熒光強(qiáng)度逐漸趨于平穩(wěn),結(jié)果表明了探針BOTC和Cu2+的反應(yīng)十分迅速,響應(yīng)時(shí)間小于1 min。

為了研究HEPES緩沖pH值的不同對(duì)探針BOTC以及加入Cu2+后的影響,我們檢測(cè)了在pH 3～14的范圍內(nèi)體系熒光強(qiáng)度的變化(圖6)。可以發(fā)現(xiàn),探針本身的熒光強(qiáng)度隨著緩沖液pH值的變化幾乎保持不變,當(dāng)向其中加入Cu2+后,在pH 3～8的范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增加,而在pH 9～14的范圍內(nèi)逐漸降低,最后我們?nèi)∨c生物體生理環(huán)境pH相近的pH 7.4作為后續(xù)工作測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)。由檢測(cè)結(jié)果可以得知探針對(duì)pH的耐受范圍廣泛,可以滿足生物體內(nèi)測(cè)定的要求。

圖4 探針BOTC與不同濃度Cu2+反應(yīng)的吸收光譜及工作曲線Fig.4 Absorption spectra of probe upon the addition of Cu2+

圖5 探針BOTC與不同濃度Cu2+反應(yīng)的熒光光譜及工作曲線Fig.5 Fluorescence emission spectra of probe upon the addition of Cu2+

圖6 探針BOTC與Cu2+反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線及pH影響Fig.6 Working pH and Time-dependent of BoOTC with Cu2+

2.3 選擇性研究

為了研究探針BOTC對(duì)Cu2+的選擇性能,我們檢測(cè)了探針與其他生物活性物質(zhì)的熒光響應(yīng)情況(圖7)和吸收(圖8)。當(dāng)向探針BOTC溶液中分別加入其他的活性待測(cè)離子后,體系的熒光信號(hào)并沒有明顯的變化,和探針自身的熒光信號(hào)強(qiáng)度幾乎一致,而當(dāng)向探針BOTC溶液中加入后Cu2+,體系的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明探針BOTC對(duì)Cu2+有獨(dú)特的選擇性,并且表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗干擾能力。

圖7 探針BOTC對(duì)Cu2+選擇性的熒光光譜Fig.7 The selectirlty of fluorescence spectra of BOTC

圖8 探針BOTC對(duì)Cu2+選擇性的吸收光譜Fig.8 The selectivity of UV-vis spectra of BOTC

2.4 反應(yīng)機(jī)理探討

以羅丹明B為起始原料,經(jīng)過兩步反應(yīng)合成了探針BOTC(圖1)。探針本身無熒光,當(dāng)向探針體系中加入Cu2+后,Cu2+會(huì)和探針分子中的噻吩雜環(huán)絡(luò)合,生成了相應(yīng)的絡(luò)合產(chǎn)物,改變了探針分子原有的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致羅丹明分子開環(huán),產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，如圖9所示。而參比化合物因?yàn)榈I之間有兩個(gè)亞甲基,分子空間距離較大,與Cu2+不能絡(luò)合,所以不會(huì)產(chǎn)生熒光。

圖9 探針反應(yīng)機(jī)理Fig.9 The reaction mechanism of BOTC

2.5 生物應(yīng)用

為了將探針BOTC應(yīng)用于活細(xì)胞熒光成像中,采用CCK-8法實(shí)驗(yàn)來測(cè)定探針BOTC對(duì)細(xì)胞的毒性水平(圖10)。將不同濃度的探針BOTC分別加入到神經(jīng)母瘤SH-SY5Y細(xì)胞溶液中,在37℃條件下培養(yǎng)24 h后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的存活數(shù)量,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)探針BOTC濃度高達(dá)25 μmol/L時(shí),SH-SY5Y細(xì)胞的存活率依然很高,這說明探針對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞表現(xiàn)出低的細(xì)胞毒性。

圖10 探針BOTC的細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)Fig.10 Cytotoxicity assay for SH-SY5Y cells treated with probe BOTC

在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們選擇了探針BOTC濃度為10 μmol/L進(jìn)行了SH-SY5Y細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)研究(圖11)?？梢钥闯?探針本身在細(xì)胞中沒有熒光,當(dāng)加入20 μmol/L Cu2+,孵育5 min后,在540 nm處有強(qiáng)烈的熒光增強(qiáng),這說明探針BOTC對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有很好的成像效果。

圖11 探針BOTC在SH-Y5YS細(xì)胞中熒光成像分析實(shí)驗(yàn)Fig.11 Confocal fluorescence microscopic images of SH-SY5Y cells

3 結(jié) 論

將羅丹明B與水合肼在乙醇中合成羅丹明B酰肼,后加入2-噻吩甲酰氯,通過簡(jiǎn)單的兩步反應(yīng)合成探針分子BOTC,在緩沖液V(CH3CN)∶V(HEPES)=1∶1, pH=7.4中,檢測(cè)其熒光性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,只有加入Cu2+時(shí),在540 nm處產(chǎn)生出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)的發(fā)射峰,表現(xiàn)出強(qiáng)的熒光信號(hào),探針分子BOTC由無色變?yōu)榧t色,探針的熒光強(qiáng)度在Cu2+濃度為0～10 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.997 2),最低檢測(cè)線為 0.32 μmol/L。該探針BOTC具有細(xì)胞毒性低,反應(yīng)時(shí)間快,選擇性好,靈敏度高,檢出限低的特點(diǎn),并且在SH-Y5YS細(xì)胞內(nèi)有良好的熒光成像效果。該方法為生物體內(nèi)的Cu2+的檢測(cè)提供了新的思路。