孕酮回植通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與凋亡阻止小鼠月經(jīng)發(fā)生

于明明，謝 卓，金 華，王乾興

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.習(xí)水縣人民醫(yī)院 醫(yī)教科，貴州 遵義 564600)

月經(jīng)發(fā)生的實(shí)質(zhì)是體內(nèi)雌孕激素水平急劇下降誘導(dǎo)的子宮螺旋動(dòng)脈收縮，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜功能層缺血缺氧，進(jìn)而子宮內(nèi)膜細(xì)胞死亡、崩解、脫落[1]。臨床實(shí)踐推遲月經(jīng)常為月經(jīng)前3～7d口服孕酮(黃體酮)及其類(lèi)似物(炔諾酮、甲地孕酮等)，但用藥一般不超過(guò)7d，否則易出現(xiàn)用藥期間點(diǎn)滴狀出血。說(shuō)明外源性補(bǔ)充孕酮可以推遲月經(jīng)的發(fā)生，也提示孕酮推遲月經(jīng)的作用并不是無(wú)限期的，已經(jīng)分化的子宮內(nèi)膜細(xì)胞似乎有著既定的命運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)月經(jīng)期人子宮內(nèi)膜中真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)的磷酸化水平升高，并同時(shí)伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)所致的關(guān)鍵蛋白活化所需的轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcriptionfactor4，ATF4)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡信號(hào)C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)表達(dá)增加，且可被米非司酮(孕酮拮抗劑)或salubrinal(eIF2α磷酸化抑制劑)所逆轉(zhuǎn)[2～6]。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致的eIF2α相關(guān)信號(hào)可能參與了孕酮撤退誘導(dǎo)的月經(jīng)發(fā)生和孕酮對(duì)其調(diào)控的關(guān)鍵作用。但上述研究結(jié)果是在離體組織中得到的，在體情況下孕酮如何調(diào)控上述信號(hào)的表達(dá)還不清楚。本研究利用小鼠生理性孕酮撤退的月經(jīng)模型進(jìn)行孕酮回植實(shí)驗(yàn)，全面探索孕酮回植對(duì)小鼠月經(jīng)發(fā)生過(guò)程中ERS所致的自噬關(guān)鍵信號(hào)通路PERK/eIF2α/ATF4和凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵成員CHOP、Caspase12表達(dá)的調(diào)控情況，以期為月經(jīng)發(fā)生機(jī)制的解析和臨床月經(jīng)調(diào)控的時(shí)機(jī)選擇提供基礎(chǔ)性技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)8～10周齡雌性健康C57BL/6J小鼠，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2016-002)，光照周期12 h(08：00-20：00)，自由進(jìn)食和攝水，21±1℃控溫。本項(xiàng)研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。雌激素(Estrogen)購(gòu)自英國(guó)Alfa Aesar公司；孕酮(Progesterone)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；兔抗鼠PERK、鼠抗鼠ATF4、兔抗鼠CHOP多抗和鼠抗鼠GADPH單抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、Caspase12多抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，引物序列為：PERK(F：GAGATCTGGCTCAAAGACGAAA；R：AAGGAGCTATGACTTCGATCTG)、eIF2α(F：GTCTCAGACCCATCTATCTTGG；R：CATACCTGGGTGGAGCTATTAG)、ATF4(F：GACCGAGATGAGCTTCCTGAACAG；R：CCGCCTTGTCGCTGGAGAACCACC)、CHOP (F：CTCCAGATTCCAGTCAGAGTTC；R：ACTCTGTTTCCGTTTCCTAGTT)、Caspase12(F：TGGCCCATGAATCACATCTAAT；R：TGGACAAAGCTTCAGTGTATCT)、GAPDH (F:TGGTGAAGACGCCAGTGGA；R：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC)；RNAiso Plus試劑盒和real-time PCR試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司。

1.2 小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)模型的建立及孕酮回植實(shí)驗(yàn) 參考本課題組前期工作進(jìn)行[7]。將30只C57BL/6J雌鼠在乙醚麻醉下行雙側(cè)卵巢去除術(shù)。小鼠術(shù)后恢復(fù)1周以清除內(nèi)源性雌孕激素的干擾，而后雌孕激素序貫干預(yù)，最后將20 μL花生油注入小鼠的子宮腔以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜蛻膜化，49 h后移除孕酮皮埋管。將小鼠分為12 h組、16 h組和孕酮回植組(每組10只)，其中12 h組和16 h組分別在皮埋管移除后12 h和16 h處死；回植組則在皮埋管移除后12 h再次回植皮埋管并在16 h處死。收集小鼠雙側(cè)子宮角，生理鹽水沖洗后裝入去酶EP管液氮中凍存或盛有固定液的EP管中待用。

1.3 real-time PCR檢測(cè)PERK、eIF2α、ATF4、CHOP和Caspase12 mRNA表達(dá) RNAiso Plus試劑盒提取小鼠全子宮總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，20μL體系進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，目的基因的相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct表示。

1.4 蛋白印跡法檢測(cè)t-PERK、p-PERK、t-eIF2α、p-eIF2α、ΑTF4 、CHOP和Caspase12蛋白表達(dá) 取約100 mg小鼠全子宮，加入1 mL混合液(組織裂解液、PMSF、蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑按100∶1∶1∶1配制)提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。40 μg蛋白上樣，80 V恒壓電泳，冰上轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，一抗(t-PERK 1∶1 000；p-PERK 1∶1 000；t-eIF2α 1∶1 000；p-eIF2α 1∶1 500；ATF4 1∶1 500;CHOP 1∶800；Caspase12 1∶2 000；GAPDH 1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后常溫孵育二抗2 h，ECL顯影，Image Pro Plus進(jìn)行條帶分析。

1.5 免疫組化法檢測(cè)p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP和Caspase12蛋白的原位表達(dá) 小鼠全子宮10%中性甲醛過(guò)夜固定后石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后高壓法修復(fù)抗原，一抗(p-PERK 1∶100；p-eIF2α 1∶150;ATF4 1∶100;CHOP 1∶50;Caspase12 1∶100)4 ℃過(guò)夜。PBS洗片后滴加二抗，37 ℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后OLYMPUS光學(xué)顯微鏡下拍攝圖像。

2 結(jié)果

2.1 小鼠子宮組織中PERK、eIF2α、ATF4的表達(dá) 如圖1、圖2，12 h組和孕酮回植組PERK、eIF2α和ATF4 mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異，但均明顯高于16 h組(P<0.05)。在蛋白水平上，各組子宮內(nèi)膜組織中總PERK(t-PERK)和總eIF2α(t-eIF2α)表達(dá)未見(jiàn)顯著差異；但其磷酸化蛋白(p-PERK、p-eIF2α)在12 h組和孕酮回植組是顯著升高的，因而其活性表現(xiàn)形式(p-PERK/t-PERK、p-eIF2α/t-eIF2α的比值)及ATF4表達(dá)量顯著高于16 h組(P<0.05)。如圖3，免疫組化結(jié)果顯示，p-PERK、p-eIF2α和ATF4蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的分布情況類(lèi)似，表達(dá)于子宮內(nèi)膜基底層與蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞交界處的基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，且12 h組和孕酮回植組表達(dá)強(qiáng)度相似，均高于16 h組。

*:與12 h組相比較,P<0.05；#:與孕酮回植組比較,P<0.05。 圖1 孕酮回植對(duì)小鼠子宮 PERK、eIF2α和ATF4 mRNA表達(dá)的影響(real-time PCR)

*:與12 h組相比較, P<0.05；#:與孕酮回植組比較,P<0.05。圖2 孕酮回植對(duì)小鼠子宮PERK、eIF2α和ATF4蛋白表達(dá)的影響(Western blot)

圖3 孕酮回植對(duì)小鼠子宮p-PERK、p-eIF2α和ATF4 蛋白原位表達(dá)的影響(IHC，SP法)

2.2 小鼠子宮組織中CHOP和Caspase12的表達(dá) 如圖4，孕酮回植組和12 h組的CHOP和Caspase12在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)無(wú)明顯差異，但均明顯低于16 h組(P<0.05)。同時(shí)免疫組化結(jié)果顯示，CHOP和Caspase12蛋白在12 h組和孕酮回植組表達(dá)強(qiáng)度類(lèi)似，都顯著低于16 h組，主要表達(dá)于充分蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(見(jiàn)圖5)。

*：與12 h組比較，P<0.05；#：與孕酮回植組比較，P<0.05。圖4 孕酮回植對(duì)小鼠子宮CHOP和Caspase12 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

圖5 孕酮回植對(duì)小鼠子宮組織CHOP和Caspase12蛋白原位表達(dá)的影響(IHC，S-P法)

3 討論

月經(jīng)周期貫穿于女性的整個(gè)生育期，月經(jīng)是否規(guī)律對(duì)其生活質(zhì)量影響巨大。闡明月經(jīng)發(fā)生機(jī)制，將可為臨床上經(jīng)血過(guò)多、過(guò)少、痛經(jīng)等子宮內(nèi)膜異常出血相關(guān)疾病的治療及月經(jīng)周期的人工干預(yù)提供新的策略。

目前認(rèn)為月經(jīng)發(fā)生存在由血管外周細(xì)胞介導(dǎo)的可逆階段和白細(xì)胞介導(dǎo)的不可逆階段。在可逆階段通過(guò)孕酮的補(bǔ)充可阻斷子宮內(nèi)膜的崩解[8]，從而推測(cè)月經(jīng)發(fā)生存在一個(gè)可為孕酮逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵時(shí)期。這已在恒河猴[9]和小鼠模型中得到了證實(shí)，其中小鼠中這一關(guān)鍵時(shí)期在孕酮撤退后12 h，即在孕酮撤退后12 h回植孕酮能阻斷月經(jīng)發(fā)生，16 h回植則不能[7]。但孕酮是如何調(diào)控子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的生存或死亡的？目前并不清楚。

細(xì)胞自噬是一個(gè)受基因調(diào)控的、涉及具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體形成，并將物質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中降解的復(fù)雜過(guò)程[10]。正常情況下，細(xì)胞通過(guò)基礎(chǔ)水平的自噬清除受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。研究表明，自噬缺陷小鼠表現(xiàn)出錯(cuò)誤折疊的受損蛋白質(zhì)的累積[11]。自噬與凋亡參與人類(lèi)月經(jīng)發(fā)生已有零星報(bào)道[12]，但尚缺乏系統(tǒng)、全面的研究。PERK(protein kinase RNA-like ER kinase，蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶)是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，其活性受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)的調(diào)節(jié)[11]。正常情況下，PERK與GRP78結(jié)合而無(wú)活性；當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，特異性地觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，PERK與GRP78分離而磷酸化被快速激活[13-14]，進(jìn)而磷酸化eIF2α，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的整體水平，減輕UPR而維持細(xì)胞生存；但當(dāng)ERS進(jìn)一步加劇時(shí)，eIF2α也可上調(diào)ATF4表達(dá)[3]，進(jìn)而直接上調(diào)CHOP表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究通過(guò)在月經(jīng)發(fā)生關(guān)鍵時(shí)期之前(孕酮撤退后12 h)回植孕酮，將其與孕酮撤退后12 h和16 h小鼠子宮中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬和凋亡情況進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然各組PERK、eIF2α總蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異，但在12 h組和孕酮回植組，其mRNA表達(dá)量、磷酸化形式的蛋白及其下游信號(hào)ATF4的表達(dá)量卻顯著高于16 h組。與此同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡信號(hào)CHOP和Caspase12 mRNA和蛋白表達(dá)模式剛好相反，即在12 h和回植組顯著低于16 h組。由此提示，孕酮撤退后12 h，小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生了ERS，誘導(dǎo)UPR，激活PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)通路的表達(dá)，增強(qiáng)自噬作用以清除異常蛋白質(zhì)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。但當(dāng)孕酮撤退時(shí)間延長(zhǎng)到16 h，基質(zhì)細(xì)胞的UPR反應(yīng)進(jìn)一步加重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)已無(wú)法有效清除積累的異常蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的凋亡信號(hào)CHOP和Caspase12表達(dá)。這兩種凋亡蛋白的表達(dá)一方面負(fù)反饋抑制其上游PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)表達(dá)，另一方面介導(dǎo)各自的特異凋亡途徑或共同協(xié)調(diào)誘導(dǎo)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的凋亡[16-17]。而這一效應(yīng)可被在孕酮撤退后12 h回植孕酮所阻斷，說(shuō)明孕酮回植能有效維持較高水平的自噬并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異的凋亡蛋白表達(dá)，從而阻斷小鼠月經(jīng)的進(jìn)程。需要指出的是，PERK和eIF2α的mRNA的變化趨勢(shì)與其磷酸化蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致，而與總蛋白表達(dá)趨勢(shì)不符，說(shuō)明這兩種蛋白的活性可能不在翻譯水平，而是在翻譯后水平上的快速磷酸化而調(diào)控的[18-20]。

綜上所述，孕酮撤退后12 h回植孕酮能有效阻斷月經(jīng)發(fā)生的進(jìn)程，可能是通過(guò)維持小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中ERS誘導(dǎo)的自噬信號(hào)通路PERK/eIF2α/ATF4表達(dá)并抑制凋亡關(guān)鍵信號(hào)CHOP和Caspase12表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。