不同干燥條件的三七中三七素含量的測定

宋建平，婁 潔，張志信，梁 教

（文山學(xué)院 化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663099）

三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人參屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)珍貴中藥材，為云南省文山州道地藥材。三七飲片具有“散瘀止血，消腫定痛、益氣活血的功效。用于跌撲腫痛、內(nèi)外出血、氣虛血瘀、脈絡(luò)瘀阻、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱，氣虛體弱；軟組織挫傷、出血性疾病、高血壓、冠心病、腦卒中、高脂血癥、糖尿病血管病變、免疫功能低下見上述證候者”[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為三七有生、熟用藥之分及“生打熟補(bǔ)”，生三七用于止血祛瘀、消腫止痛，熟三七主要用于補(bǔ)血、補(bǔ)氣。有學(xué)者研究認(rèn)為，三七的生熟之分主要是炮制過程中三七中的各種化學(xué)成分含量、結(jié)構(gòu)、比例均發(fā)生改變而引起[2]。三七素是三七中存在的一種特殊的水溶性氨基酸，其化學(xué)名為β-草酰-L-α，β-二氨基丙酸，1981年日本學(xué)者首次從三七中發(fā)現(xiàn)將其命名為三七素。藥理研究證明，三七素能明顯縮短凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間，提高血小板數(shù)和黏附率，增強(qiáng)血小板的功能，起到止血的作用[3]。三七的干燥方法傳統(tǒng)上采用自然晾曬，近年來隨著產(chǎn)量增加采用快速烤房干燥的三七量已占絕大多數(shù)。對三七中皂苷在不同干燥條件下的變化研究較多，但對三七素的影響尚未見報(bào)道?；谌咚赜幸欢ǖ纳窠?jīng)毒性，在干燥階段是否對其含量有影響，對三七飲片的深度開發(fā)有指導(dǎo)意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

鮮三七：購買于云南省文山州三七國際交易市場；冷凍干燥三七（文山華信三七股份有限公司、云南省文山市華信三七加工廠加工處理；生產(chǎn)批號：1601001；生產(chǎn)日期：2016/01/06）；三七素標(biāo)準(zhǔn)品（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，純度＞98%、BZP1872）；甲醇（色譜級，Sigma公司）；超純水（娃哈哈礦泉水）。

本實(shí)驗(yàn)所用鮮三七均來源于云南省文山州，采收期為2017年12月。經(jīng)過不同的干燥方式干燥處理而成（冷凍干燥三七除外，下同），樣品信息見表1。

表1 樣品采集信息

1.2 儀器

Thermo SCINTIFIC U3000型高效液相色譜儀（德國賽默飛公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（四川中智旗云通用設(shè)備有限公司）；高速萬能粉碎機(jī)FW135型（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；ISO-9001型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；80-2型低速臺式離心機(jī)（金壇市大地自動化儀器廠）；SK-18TC超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；W201D數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；津騰尼龍66（Nylon）0.22um微孔濾膜；醫(yī)用注射器；移液槍（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

2 方法與過程

2.1 液相條件

Thermo SCINTIFIC U3000型高效液相色譜儀，SyncronisC18（150 mm×4.6 mm，5 um）色譜柱；流動相為：甲醇—（0.1%磷酸）∶水（85∶15）；等度洗脫15 min；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫25 ℃；檢測波長213 nm。

2.2 三七素含量測定方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取三七素標(biāo)準(zhǔn)品（相對分子質(zhì)量為176.13）0.0050 g于150 mL燒杯中，加入一定量超純水，超聲處理使其完全溶解，定容于25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

設(shè)置序列進(jìn)樣量為 1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 uL、10 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（對應(yīng)濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg/μL），依次進(jìn)樣按照 2.1的色譜條件測定三七素的峰面積值。以峰面積值（y）對樣品量（x）進(jìn)行線性回歸，如圖1，得線性回歸方程為：y=21.257x+0.2325,得到R2=0.9999。由圖1可知：三七素的樣品量在0～2.0 μg范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 三七素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 樣品的處理

將新鮮三七清洗，去除須根，再切片。按表2的干燥方式進(jìn)行處理，再將不同干燥方式下得到的三七放入高速萬能粉碎機(jī)粉碎，得到三七干燥粉末。

稱取不同干燥方式的三七粉末1.0000 g（詳細(xì)稱取信息見表2），放于具塞錐形瓶中，料液比為1∶10（g∶mL），加入蒸餾水10 mL，在功率為750 W，頻率為25 kHz,水浴溫度為25 ℃的超聲清洗器中超聲15 min連續(xù)提取2次，將濾液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，合并兩次上清液于40 ℃的恒溫水浴鍋濃縮20 min，再將其轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度線，得到該系列的三七素提取液。

首先，取適量該系列三七提取液于定性濾紙上，再加入2滴4%茚三酮溶液，進(jìn)行顯色反應(yīng)[4]；其次，用注射器取適量的三七素提取液過0.22 μm微孔濾膜，裝入進(jìn)樣瓶中，并做好標(biāo)記；最后，將處理好的樣品置于進(jìn)樣盤上進(jìn)行含量測定。

表2 樣品的稱取質(zhì)量

2.2.4 茚三酮顯色劑的配制

精確稱取苯并戊三酮2.0000 g，用蒸餾水溶解轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中并定容至刻度線。

2.2.5 內(nèi)標(biāo)法的制作

用移液槍移取等量的三七素標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品液1于同一裝樣瓶中，超聲3 min后按照2.1中液相條件進(jìn)行三七素含量的測定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC如圖2所示

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC圖

3.2 三七素的保留時(shí)間

實(shí)驗(yàn)得到樣品與三七素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對比圖，如圖3所示，最上為標(biāo)準(zhǔn)品，1～8號依次從上往下，進(jìn)行對比可知，保留時(shí)間都在1.5 min。

圖3 1～8號樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中三七素的HPLC圖

3.3 內(nèi)標(biāo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

將1號樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、加內(nèi)標(biāo)的1號樣品HPLC的峰面積進(jìn)行對比，如圖4所示，1.5 min處的峰由上到下依次為：1號樣品、加內(nèi)標(biāo)的1號樣、標(biāo)準(zhǔn)品的三七素峰。

圖4 1號樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、加內(nèi)標(biāo)的1號樣品的HPLC圖

3.4 三七素含量測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由測得的三七素峰面積按照線性回歸方程為：y=21.257x+0.2325進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表3所示。

表3 三七素的含量

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用低溫超聲提取，離心分離得到三七素粗提液，克服了分離難的問題，又避免了三七素受到高溫作用而可能發(fā)生的變性問題。用HPLC法測定不同干燥條件的樣品粗提液中三七素的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同的提取方法下，不同的干燥溫度并未發(fā)現(xiàn)三七素的含量呈線性變化，40 ℃烘干和日光自然曬干條件下三七的含量最低，而在烘箱干燥50 ℃條件下三七素的含量最高。可能與溫度較低時(shí)干燥的時(shí)間需要更長，三七中的酶對三七素有一定的分解作用有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)樘崛〉臉悠窙]有經(jīng)過分離純化，在三七素粗提液中含有較多的雜質(zhì)，所以粗提液要放置3 d之后再進(jìn)行測定。此時(shí)粗提液中的其它雜質(zhì)物質(zhì)會沉降下來，在經(jīng)過微孔濾膜的過濾可以使原本溶于水而沉降出來的雜質(zhì)與三七素分離。實(shí)驗(yàn)所用的液相條件對三七素的色譜峰與其余雜峰達(dá)到很好的分離效果。