三七育種研究綜述

熊 高，王 勇，胡永媛，高麗芳，孫玉琴，陳中堅

（文山學(xué)院 文山三七研究院，云南 文山 663099）

三七 [Panax notoginseng（BurK.）F.H.Chen]為五加科人參屬多年生草本植物，其主要活性成分皂苷對代謝、血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病具有很好的療效[1-3]，在400余年的栽培歷史中，已發(fā)展成為產(chǎn)業(yè)化程度高、市場規(guī)模大、研究較為深入的名貴中藥材品種[4]。同時，在2016年云南省政府提出的實現(xiàn)三七產(chǎn)業(yè)千億目標(biāo)的大背景下[5]，將為三七及其產(chǎn)業(yè)在種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)利用、改良創(chuàng)新等方面提供良好機(jī)遇。

品種作為一個產(chǎn)業(yè)得以持續(xù)健康發(fā)展的基礎(chǔ)，而育種則是實現(xiàn)品種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性優(yōu)良最有效、最根本的途徑。三七從馴化到人工種植至今，其品種選育工作經(jīng)歷了漫長的歲月，在此期間，通過許多三七育種工作者的辛勤付出，三七在品種選育研究上取得了重要的成就，為我國中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展和農(nóng)民脫貧致富提供了產(chǎn)業(yè)支撐。

近年來，隨著三七栽培面積的不斷擴(kuò)大，三七病害嚴(yán)重，加之連作障礙的影響，三七道地產(chǎn)區(qū)逐漸向非道地產(chǎn)區(qū)轉(zhuǎn)移，這將導(dǎo)致三七藥材品質(zhì)下降，藥效降低與道地性喪失。同時，由于三七抗病資源的研究利用進(jìn)展緩慢，無很好的抗病品種，種植中人為的濫用農(nóng)藥，導(dǎo)致三七農(nóng)殘超標(biāo)[6]。再者，隨著公眾日益增長的健康要求以及中藥材品質(zhì)升級無公害行動計劃的提出[7]，三七品種目前還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了產(chǎn)業(yè)的需求，特別是優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗病性強(qiáng)的新品種相對缺乏。因此，培育優(yōu)良三七品種是三七科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需要，也可為三七生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藥材奠定基礎(chǔ)。本文綜述了三七育種的發(fā)展歷程，并對三七育種的未來研究進(jìn)行了的展望，以供三七育種領(lǐng)域的研究者借鑒、參考和討論。

1 三七傳統(tǒng)育種技術(shù)的早期應(yīng)用

傳統(tǒng)育種主要基于現(xiàn)有的自然變異資源，通過系統(tǒng)選擇、雜交、多世代篩選和純化，最終獲得具有目標(biāo)性狀的品種，整個選育過程周期長，成本高。由于三七生態(tài)適應(yīng)性差、生長周期長、地理分布窄等特性，三七育種進(jìn)展相比于其他糧食作物顯得十分緩慢。自上個世紀(jì)90年代才開始對三七變異類型進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，獲得了莖色、莖粗、塊根、株高、葉寬等性狀的變異類型[8]。之后，陳中堅等[9-10]（2004年、2010年）進(jìn)行相關(guān)和通徑研究，最終認(rèn)為寬葉三七、復(fù)葉柄平展型三七、紫根三七和長形根三七等4種變異類型可作為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)三七新品種的育種目標(biāo)。

以系統(tǒng)選育的傳統(tǒng)育種技術(shù)是目前三七育種工作中最基本、最重要的育種途徑。苗鄉(xiāng)三七科技有限公司通過12年的系統(tǒng)選育，在2015年培育出“苗鄉(xiāng)三七一號”（綠莖）和“滇七一號”（紫莖）兩個三七品種并獲得認(rèn)定，這是文山州人工種植三七數(shù)百年來首獲的品種，開創(chuàng)了三七育種新歷史；同樣，在多家單位的共同努力下，經(jīng)過15年5個世代典型性狀選擇和純化的系統(tǒng)選育，2019年文山學(xué)院與苗鄉(xiāng)三七科技有限公司共同培育出以紫根性狀為主的“文院紫七1號”和以復(fù)葉柄夾角小為性狀的“苗鄉(xiāng)三七2號”兩個三七新品種。這些品種具有生活力強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的特點。此外，雜交選育、倍性育種、輻射誘變等技術(shù)在三七傳統(tǒng)育種研究中都有報道，比如，孫玉琴[11-12]等對三七開花、散粉規(guī)律研究，確定了三七雜交育種的最佳授粉時間為10∶00～14∶00，花粉常溫下可保存8 h，低溫儲藏時也不宜超過20 d；王朝梁等[13]利用秋水仙素對三七種子進(jìn)行染色體加倍，獲得株形高大、葉片增大、葉色濃綠等明顯特征的四倍體植株；三七60Co-γ輻射誘變研究顯示種子的半致死劑量為54 Gy，為后續(xù)三七輻射育種工作奠定基礎(chǔ)[14]。

2 三七現(xiàn)代育種技術(shù)的初步實踐

隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代育種技術(shù)在動植物育種領(lǐng)域得到大量應(yīng)用，以隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、簡單重復(fù)序列（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）等分子標(biāo)記作為輔助進(jìn)行的品種選育技術(shù)日趨成熟[15-16]，這將有助于縮短育種年限，提高育種效率。

在三七分子育種研究進(jìn)程中，早期的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用主要著重開展對三七的遺傳多樣性研究。2003年時就報道了以10bp寡核苷酸引物長度的RAPD分析方法檢測三七栽培群體的變異情況，結(jié)果表明了不管是三七不同形態(tài)性狀間，還是同一形態(tài)的不同個體間的多態(tài)性都很高，說明三七遺傳背景復(fù)雜，還是一個雜合居群，具有豐富的遺傳多樣性，并指出需通過套袋自交、花粉培養(yǎng)等途徑來進(jìn)一步純化三七遺傳背景，形成可供育種選擇具有穩(wěn)定遺傳變異類型的材料[17]。在2005-2008年間，主要以AFLP或熒光AFLP標(biāo)記對三七的遺傳多樣性進(jìn)行研究，特別是在三七栽培群體中不同植物學(xué)性狀（株高、莖色、葉片、根重）的遺傳多樣性[18]、三七不同個體根部皂苷含量差異的遺傳多樣性[19]以及三七與屏邊三七的遺傳分化[20]等方面，這些結(jié)果顯示了三七仍保持較高的生物多樣性，不過經(jīng)人工栽培后，其遺傳分化相較于野生近緣種降低。其后，Liu等人[21]和張金渝等人[22]分別開發(fā)出了用于三七生物多樣性研究的SSR和EST-SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記在三七中均顯示出高多態(tài)性，為評估三七遺傳多樣性及純系提供了標(biāo)記資源，其中發(fā)現(xiàn)通過集團(tuán)選擇方式可逐漸純化選育群體，不過不同的選育材料之間仍存在較大的遺傳分化[22]。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，可對三七在全基因組水平的遺傳差異進(jìn)行全面評價，通過簡化基因組測序（RAD-Seq）技術(shù)對12個不同區(qū)域的36份三七進(jìn)行分析，獲得近六千多個SNP位點，群體結(jié)構(gòu)顯示三七的主要遺傳變異（96.5%）發(fā)生在居群內(nèi)，而居群間遺傳分化水平低（3.5%）[23]。以上研究不僅開發(fā)出大量的分子標(biāo)記，還提供了對三七遺傳背景和變異情況的認(rèn)識，為三七分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

通過前期的不斷研究和實踐，2016年，以DNA標(biāo)記（SNP）輔助選育的首個三七抗病新品種“苗鄉(xiāng)抗七1號”通過審定，獲得品種認(rèn)證，實現(xiàn)了在三七中應(yīng)用分子標(biāo)記輔助的現(xiàn)代育種技術(shù)育成三七抗病新品種的突破。該品種基于三七抗病資源和高通量測序技術(shù)，挖掘三七抗根腐病關(guān)聯(lián)性SNP位點，根據(jù)該位點對抗病群體進(jìn)行快速檢測和選擇，最終選育而成[24]。與常規(guī)栽培種相比，接種根腐病致病菌Fusarum oxysporum后“苗鄉(xiāng)抗七1號”種子、種苗、塊根發(fā)病指數(shù)分別下降52%、72.1%、62.4%，表現(xiàn)顯著的抗性[25]?！懊玎l(xiāng)抗七1號”的獲得標(biāo)志著三七及其人參屬植物育種研究進(jìn)入了以分子生物技術(shù)為手段的分子育種時代，這將對加快藥用植物新品種選育和推廣具有積極推動作用。

3 組學(xué)大數(shù)據(jù)挖掘三七育種新潛力

組學(xué)大數(shù)據(jù)不僅可以快速揭示雜交育種潛在的深層次機(jī)理，也為品種選育提供大量分子靶標(biāo)和重要的遺傳信息。2011至2016年間，三七組學(xué)分析主要基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白組研究，這些結(jié)果在三七的三萜皂苷生物合成、生物堿合成、響應(yīng)重金屬砷脅迫方面展現(xiàn)了許多關(guān)鍵基因[26-30]。2017年，三七完成全基因組測序，獲得3萬多個編碼基因，并首次系統(tǒng)性的解析了三七皂苷的合成途徑，獲得大量皂苷合成的候選基因[31-32]。目前，已有報道顯示基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等多組學(xué)大數(shù)據(jù)用于三七研究分析[33-36]，這些研究為今后三七高品質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)，以基因組為支撐的三七遺傳育種時代已經(jīng)到來。

功能基因挖掘一直是生物學(xué)基礎(chǔ)研究的焦點，也是基因組育種時代生物學(xué)家追尋的目標(biāo)。在三七基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等組學(xué)大數(shù)據(jù)推動下，三七功能基因研究也取得了一些突破。在三七皂苷合成方面，孫穎等[37]利用RNAi技術(shù)在細(xì)胞水平下調(diào)三七環(huán)阿屯醇合酶基因CAS表達(dá)，阻斷甾醇的合成，間接增加了三七皂苷含量；楊延等[38]在三七細(xì)胞中過量表達(dá)三七法呢基焦磷酸合酶基因FPS可提高皂苷含量；李建等[33]通過對一年生和三年生三七的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，鑒定到皂苷生物合成關(guān)鍵基因達(dá)瑪烯二醇合成酶DS和P450單加氧酶CYP716A47-like在三年生三七中顯著高表達(dá)，并利用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)在煙草中驗證了功能。在三七抗病研究方面，楊丹等[39]克隆表達(dá)了三七病程相關(guān)蛋白PR10-2，通過體外抑菌活性分析顯示PR10-2蛋白可抑制三七根腐病病菌腐皮鐮刀菌和壞損柱孢菌的活性；另外，在個體水平的研究也報道了三七幾丁質(zhì)酶基因PnCHI1和多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因PGIP，對三七根腐病病菌茄腐鐮刀菌具有很好的抗性[40-41]。上述三七功能基因研究結(jié)果為三七遺傳育種工作提供了新的靶點。

4 現(xiàn)有三七新品種

在三七育種工作者的持續(xù)努力下，三七新品種實現(xiàn)了從無到有的突破，三七的新品種，最早是經(jīng)過云南省非主要農(nóng)作物品種登記的“文七1號”，但“文七1號”是在當(dāng)時特定的歷史背景下產(chǎn)生，并沒有經(jīng)過育種程序的選育，是將當(dāng)時文山種植的三七統(tǒng)稱“文七1號”，為今后選育的品種作對照。因此，目前經(jīng)過育種程序選育產(chǎn)生的品種共有5個（表1），都是經(jīng)系統(tǒng)選育的方法選育而成，其中“苗鄉(xiāng)抗七1號”在系統(tǒng)選育的基礎(chǔ)上，采用了分子標(biāo)記輔助技術(shù)。

表1 三七品種（2015-2019年）

5 展望

三七育種研究經(jīng)過長期努力取得了一定成績，不過目前三七基礎(chǔ)研究較為薄弱，系統(tǒng)選育方法仍是三七新品種選育的主要途徑，這些因素很大程度上制約了三七育種研究的步伐。為實現(xiàn)三七育種的快速發(fā)展，作者就今后三七新品種選育研究工作提出以下4個方面的展望。

（1）完善三七種質(zhì)資源保護(hù)與評價是三七育種繼續(xù)長期堅持的重點工作。種質(zhì)資源蘊藏著各種潛在的可利用基因，是育種過程的重要物質(zhì)資源和原始材料。育種工作者很早就重視三七種質(zhì)資源的收集和保存，目前文山三七研究院已建立了初具規(guī)模的三七種質(zhì)資源圃，不過對三七種質(zhì)資源的評價還很薄弱，在植物學(xué)性狀、農(nóng)藝性狀、生物學(xué)特性等方面未進(jìn)行系統(tǒng)性研究，這也是三七遺傳育種工作進(jìn)展緩慢的重要原因之一。因此，在今后的育種工作中，應(yīng)相當(dāng)長的時間著重對三七種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)評價，培育純系，只要對種質(zhì)資源隱藏的信息有了全面了解，將有助于增加育種和選種的預(yù)見性，通過各種育種方法和技術(shù)，才能不斷培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、適應(yīng)性強(qiáng)的新品種。

（2）推進(jìn)三七的倍性育種研究是快速實現(xiàn)三七新品種創(chuàng)制的有效途徑。倍性育種是植物育種的重要方式，其可以通過減少或增加染色體的數(shù)量獲得具有優(yōu)良性狀的變異個體。一般地，單倍體植物通過染色體加倍，即在一個世代就可獲得純合株系，大大縮短育種年限；而多倍體植物往往具有植株巨大、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性好、營養(yǎng)成分高的特點。基于三七生長周期長的生物學(xué)特性和增產(chǎn)塊根為目標(biāo)的生產(chǎn)特性，開展三七的倍性育種來創(chuàng)制新種質(zhì)、新品種將是一種有效途徑，具有重要的應(yīng)用前景。目前，三七的倍性育種相關(guān)工作還比較基礎(chǔ)，染色體倍性誘導(dǎo)率低，仍需進(jìn)一步探索誘導(dǎo)方式。所以，應(yīng)積極推進(jìn)三七倍性育種技術(shù)的研究，建立成熟的倍性誘導(dǎo)體系，使這一有效的育種手段早日應(yīng)用于三七育種領(lǐng)域中。

（3）構(gòu)建成熟的三七雜交體系是實現(xiàn)三七品種資源利用率高的基本保證。雜交育種是將兩個或多個品種的優(yōu)良性狀通過交配集合在一起，快速獲得擁有多個優(yōu)良性狀的單一品種，從而提高品種利用。三七的雜交育種研究已經(jīng)在三七的花器結(jié)構(gòu)、開花習(xí)性、散粉習(xí)性和花粉活力等領(lǐng)域取得了一定的進(jìn)展，今后還將繼續(xù)探索三七雜交技術(shù)、交配組合等一系列基礎(chǔ)研究工作，建立成熟的三七雜交體系，實現(xiàn)多元雜交和多基因聚合育種，為三七雜交育種應(yīng)用及實現(xiàn)品種有效利用提供保障。

（4）強(qiáng)化三七基礎(chǔ)科學(xué)研究或可為助力三七分子設(shè)計育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。三七的基因組研究得到了破譯，轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)也在三七中進(jìn)行了大量應(yīng)用，三七正在快步走向“發(fā)現(xiàn)基因、研究基因、利用基因”的研究模式。盡管目前三七的基礎(chǔ)理論研究與創(chuàng)新方面獲得了不錯的進(jìn)展，但是與其他農(nóng)作物，比如水稻、玉米、小麥的科學(xué)研究相比還有一定距離，尚不能對三七育種研究提供有效支撐。那么，在如今生命科學(xué)高速發(fā)展的時代，為能實現(xiàn)三七在遺傳育種研究中“一個基因一個品種”的模式，就亟需進(jìn)一步強(qiáng)化三七基礎(chǔ)科學(xué)研究，特別是針對三七在主要經(jīng)濟(jì)性狀、抗性、適應(yīng)性等方面的機(jī)理展開系統(tǒng)性研究，以獲得更多效果顯著、作用機(jī)制清晰的靶標(biāo)分子，為三七分子設(shè)計育種應(yīng)用奠定堅實基礎(chǔ)。