食源性致病菌菌株多相異質(zhì)性對微生物風(fēng)險(xiǎn)評估的影響研究進(jìn)展

俞文英，張昭寰，劉海泉,2,3，Pradeep Kumar MALAKAR，潘迎捷,2,3，趙 勇,2,3,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306 ；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306 ；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306 ）

食品微生物風(fēng)險(xiǎn)評估是國際公認(rèn)的用于制定有效的食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)管措施的必要手段和科學(xué)基礎(chǔ)，總目標(biāo)是避免食品中致病微生物引起的食源性疾病的發(fā)生，保障食品安全[1]。1998年國際食品法典委員會擬定了微生物風(fēng)險(xiǎn)評估的原則和指導(dǎo)方針草案，提出微生物風(fēng)險(xiǎn)評估包括危害識別、危害特征描述、暴露評估和風(fēng)險(xiǎn)描述4 個步驟[2]。食源性致病菌引起的食品安全問題是全球性問題，中國面臨的情況更為嚴(yán)峻。在中國龐大的人口基數(shù)下，風(fēng)險(xiǎn)評估人員所做的風(fēng)險(xiǎn)決策影響深遠(yuǎn)，而食源性致病菌菌株多相異質(zhì)性的存在直接影響微生物風(fēng)險(xiǎn)評估過程的準(zhǔn)確性與可靠性，威脅我國人民的健康安全。因此，相對準(zhǔn)確和可靠的風(fēng)險(xiǎn)評估過程對人民的健康安全至關(guān)重要，加強(qiáng)食源性致病菌菌株多相異質(zhì)性的風(fēng)險(xiǎn)評估研究刻不容緩。

1998年，菌株異質(zhì)性概念最早出現(xiàn)在Murphy等[3]的研究中，他們指出異質(zhì)性能真實(shí)地反映種群的差異性。1999年，Anderson等[4]進(jìn)一步提出，菌株異質(zhì)性是菌株的特性，不能通過增加實(shí)驗(yàn)的次數(shù)來降低。2013年，Lianou等[5]將異質(zhì)性具體的分為毒力異質(zhì)性、生長異質(zhì)性、失活異質(zhì)性以及生物被膜形成異質(zhì)性。在總結(jié)國內(nèi)外文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，本文提出微生物菌株多相異質(zhì)性的概念。菌株多相異質(zhì)性是微生物固有的屬性，表現(xiàn)為菌株表型多相特性的差異。菌株多相異質(zhì)性不能通過簡單的改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法或者增加實(shí)驗(yàn)次數(shù)來降低[3]，最新研究中通過優(yōu)化的隨機(jī)模型、組學(xué)技術(shù)等將菌株多相異質(zhì)性進(jìn)行擬合，以降低菌株多相異質(zhì)性對風(fēng)險(xiǎn)評估的影響。菌株多相異質(zhì)性主要包括生長和失活、毒力、被膜形成以及耐藥異質(zhì)性[5-6]。相比而言，微生物多樣性在狹義上指微生物物種多樣性；廣義上指從微生物生命活動層次的角度，可以將微生物多樣性分為遺傳（基因）多樣性、生理多樣性、物種多樣性和生態(tài)多樣性4 個層面[7]。菌株多相異質(zhì)性更強(qiáng)調(diào)表型的差異性，而多樣性則更強(qiáng)調(diào)種類的變化。相較于國外，目前我國食品相關(guān)的菌株多相異質(zhì)性研究還很欠缺，甚至幾近空白。

本文總結(jié)了菌株多相異質(zhì)性的概念，并在此基礎(chǔ)上分析了菌株多相異質(zhì)性的4 個存在形式，探討了菌株多相異質(zhì)性對風(fēng)險(xiǎn)評估的影響及解決措施，提出了微生物風(fēng)險(xiǎn)評估宏模型，以期為后續(xù)菌株多相異質(zhì)性的深入研究提供科學(xué)指導(dǎo)，為全面提升風(fēng)險(xiǎn)評估準(zhǔn)確性和可靠性提供理論依據(jù)。

1 生長和失活異質(zhì)性

在四大類菌株多相異質(zhì)性中，生長和失活異質(zhì)性對食品微生物風(fēng)險(xiǎn)評估的影響最大，生長和失活異質(zhì)性會影響風(fēng)險(xiǎn)評估的“危害特性描述”和“暴露評估”過程。而菌株效應(yīng)并沒有在微生物劑量反應(yīng)方程中體現(xiàn)出來，是導(dǎo)致劑量反應(yīng)模型不準(zhǔn)確的主要原因之一，將直接體現(xiàn)在風(fēng)險(xiǎn)評估的結(jié)果上。

1.1 生長異質(zhì)性

通過國內(nèi)外研究得出，食源性致病菌生長異質(zhì)性主要表現(xiàn)為延滯期、指數(shù)生長期、生長速率及傳代時間異質(zhì)性。

1.1.1 單增李斯特菌生長異質(zhì)性

20世紀(jì)80年代，Rosenow等[8]首次發(fā)表了單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）生長異質(zhì)性的文章。Avery等[9]發(fā)現(xiàn)臨床分離株（（2.17±0.30）h）比豬肉分離株（（2.66±0.60）h）具有更短的延滯期。在4 ℃饑餓條件下處理后，臨床分離株（（3.59±0.57）h）與豬肉分離株（（4.61±0.71）h）的延滯期異質(zhì)性更為明顯。最近，Aryani[10]和Marina[11]等的研究中也提到單增李斯特菌生長異質(zhì)性。Aryani等研究了在不同pH值（pH 4.2～7.3）、水分活度（添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%～12.5%氯化鈉）、游離乳酸濃度（0、3、4、5、6 mmol/L）以及溫度（0～30 ℃）條件下對20 株單增李斯特菌最大生長速率的影響，并用均方根誤差對菌株異質(zhì)性進(jìn)行量化。Marina等研究了單增李斯特菌（Listeria monocytogenes CECT 5672）在高靜水壓（350、400、450 MPa）下分別處理3、16、23 min后，培養(yǎng)基pH值（pH 5、6、7）和氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、0.5%、1.0%）對單增李斯特菌生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高靜水壓處理后，單增李斯特菌的延滯期隨著培養(yǎng)基中環(huán)境壓力的增大而延長。即靜水壓力越大、處理時間越長、pH值越低、氯化鈉濃度越高，培養(yǎng)基的環(huán)境壓力越大，單增李斯特菌的延滯期越長，生長異質(zhì)性越大。

1.1.2 沙門氏菌的生長異質(zhì)性

Fehlhaber等[12]通過肉湯培養(yǎng)的方法，以傳代時間作為指標(biāo)，評估了從食品中分離的沙門氏菌（Salmonella spp.）的生長異質(zhì)性。研究表明，在7～42 ℃下，45 株沙門氏菌有顯著的生長異質(zhì)性。Díez-García等[13]比較了10 個血清型共69 株沙門氏菌的生長行為（延滯期和生長速率），得出不同血清型沙門氏菌之間存在生長異質(zhì)性。

1.1.3 副溶血性弧菌生長異質(zhì)性。

Liu Bingxuan等[14]研究在10、20、30、37 ℃，鹽度為0.5%、3%、5%、7%、9%的條件下，通過自動濁度檢測系統(tǒng)Bioscreen C，分析50 株來源不同的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的生長異質(zhì)性。結(jié)果表明，就溫度和鹽度而言，隨著培養(yǎng)條件愈加偏離最適條件，副溶血性弧菌的生長異質(zhì)性也逐漸增大；且溫度對菌株生長異質(zhì)性的影響更大。淡水及淡水水產(chǎn)品中得到的菌株比海水及海產(chǎn)品中分離株的生長異質(zhì)性更大。帶有致病基因tdh的菌株比不帶有該致病基因的菌株生長異質(zhì)性更大。

另外，對大腸桿菌O157:H7（Escherichia Coli O157:H7）[15]和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[16]也有相關(guān)的生長異質(zhì)性的研究。除了關(guān)于以上列出的菌株生長異質(zhì)性的研究實(shí)例之外，食源性致病菌之間的生長異質(zhì)性也表現(xiàn)為多菌株環(huán)境中某一菌株生長或不生長異質(zhì)性[5]。

基于以上分析，生長異質(zhì)性現(xiàn)象廣泛存在于單增李斯特菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等食源性致病菌之中。影響菌株生長異質(zhì)性的主要因素有環(huán)境因素（主要包括溫度、鹽度、pH值及培養(yǎng)基條件等）、血清型、毒力基因型、菌株來源等。環(huán)境條件越不適于菌株生存，菌株間所表現(xiàn)出的生長異質(zhì)性越明顯。

1.2 失活異質(zhì)性

在總結(jié)國內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上，將菌株的失活異質(zhì)性分為3 類：酸失活、熱失活和非熱加工失活[6]。

酸失活主要針對單增李斯特菌、沙門氏菌以及大腸桿菌等。Dykes等[17]的研究顯示，用鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.5的條件下，30 株來自臨床和食品的單增李斯特菌存在明顯的失活異質(zhì)性。相較于食品中分離的單增李斯特菌，臨床菌株并未表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐酸性。Berk等[18]研究37 株鼠傷寒沙門氏菌，在鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.5的條件下處理2 h，結(jié)果顯示這37 株菌株表現(xiàn)出了明顯的失活異質(zhì)性。此外，大腸桿菌的酸失活異質(zhì)性也屢有報(bào)道[19]。

熱失活中常用D值（在一定的處理環(huán)境和一定的熱力致死溫度條件下，某細(xì)菌數(shù)群中每殺死90%原有殘存活菌數(shù)時所需要的時間）評估菌株的失活率。熱殺菌是工業(yè)中常用的殺菌方式，研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等均在熱處理的條件下表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。Aryani等[20]研究了20 株單增李斯特菌在55、60、65 ℃ 3 個巴氏殺菌溫度下的菌株失活異質(zhì)性。在55 ℃條件下，單增李斯特菌D值在9～30 min之間；60 ℃條件下，D值在0.6～4 min之間；65 ℃條件下，D值在0.08～0.6 min之間?？梢园l(fā)現(xiàn)，55 ℃條件下的D值顯著長于60 ℃和65 ℃，且在3 個溫度下20 株單增李斯特菌均表現(xiàn)了較高的失活異質(zhì)性。此外，升溫速率會直接影響金黃色葡萄球菌（S. aureus ATCC 25923）的D值[21]。在pH 3.0和加熱溫度57 ℃條件下，沙門氏菌酸失活菌株異質(zhì)性顯著高于熱失活菌株[22]。

非熱加工技術(shù)主要有高壓殺菌、電磁殺菌、輻照殺菌及脈沖電場等。同時，環(huán)境因素（氧化物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)缺失等）也會促使菌株表現(xiàn)出不同程度的失活異質(zhì)性[23]。低濃度的戊二醛、高靜水壓（300 MPa、10 min）以及中等溫度（50 ℃）處理會顯著增加金黃色葡萄球菌（ATCC 25923和BEC 9393）的失活數(shù)量級[24]。

綜上所述，食源性致病菌的失活異質(zhì)性除了與殺菌的方式有關(guān)，還與菌株自身對酸、熱、高壓以及電磁等的耐受能力有關(guān)。失活異質(zhì)性的存在加大了工業(yè)生產(chǎn)中殺菌的難度，最終對危害特征描述甚至微生物風(fēng)險(xiǎn)評估過程的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。

2 生物被膜形成異質(zhì)性

生物被膜是指微生物黏附于接觸表面，分泌胞外多聚物等黏性基質(zhì)，將自身包裹其中而形成的大量細(xì)菌聚集物。在食品生產(chǎn)的過程中，生物被膜可以黏附在食品加工設(shè)備表面、管道接口、操作臺面等，而且不易被日常清潔措施清除[25]。全世界每年都要花費(fèi)數(shù)十億美元用于處理由生物被膜造成的設(shè)備損壞、產(chǎn)品污染、能源損失以及人類傷口感染等問題[26]。美國疾病預(yù)防中心將生物被膜及由生物被膜引起的感染列入21世紀(jì)阻礙醫(yī)療行業(yè)前進(jìn)的七大障礙之一[27]。

Nilsson等[28]研究了溫度、pH值、菌株來源、血清型等對95 株單增李斯特菌生物膜產(chǎn)量的影響。在選取的實(shí)驗(yàn)條件下，溫度與pH值越不適于菌株生長，生物被膜的生成量異質(zhì)性越明顯。且在相同的培養(yǎng)條件下，臨床菌株生物被膜的生成量高于環(huán)境菌株。血清型為1/2a的單增李斯特菌被膜的生成量顯著高于其他菌株。

Kadam等[29]的研究則證明了環(huán)境營養(yǎng)條件能影響生物被膜的生成量。他們在12、20、30、37 ℃ 4 個溫度條件下，將143 株單增李斯特菌在營養(yǎng)豐富、營養(yǎng)中等以及營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)果表明，溫度對單增李斯特菌的被膜生成量有很大影響，在4 種溫度條件下，隨著溫度的升高，單增李斯特菌的被膜生成量增加。相對于營養(yǎng)條件好的培養(yǎng)條件，營養(yǎng)缺乏的條件下生物被膜的生成量更多。在20、30、37 ℃且營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，相較于1/2b和1/2a血清型菌株，血清型為4b的單增李斯特菌產(chǎn)生被膜的能力較弱。在營養(yǎng)缺乏時，1/2b血清型菌株被膜生成量最高，1/2a和4b血清型菌株的被膜生成量相當(dāng)。

趙愛靜[30]采用結(jié)晶紫染色方法對39 株副溶血性弧菌在5 個溫度以及3 種食品接觸材料表面的生物被膜形成情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，不同溫度條件下，生物被膜形成能力由強(qiáng)到弱為：25 ℃＞37 ℃＞15 ℃＞10 ℃＞4 ℃；在不同食品接觸材料表面生物被膜形成能力排序?yàn)椋翰ＡВ揪郾揭蚁静讳P鋼；溫度對生物被膜形成的影響大于接觸材料；致病性菌株生物被膜形成能力大于非致病菌株。

綜上所述，細(xì)菌生物被膜形成的異質(zhì)性不僅受到菌株來源、培養(yǎng)環(huán)境、血清型等因素的影響，還與其所接觸的材料密切相關(guān)[28-30]。生物被膜異質(zhì)性的存在加劇了致病菌清除的難度，也造成了風(fēng)險(xiǎn)評估尤其是殺菌技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)降低效能評估的不確定性和變異性。

3 毒力異質(zhì)性

危害特征描述要求掌握食品加工過程中菌株毒力的相關(guān)變化。毒力異質(zhì)性也會對劑量反應(yīng)模型的建立產(chǎn)生影響。對于微生物風(fēng)險(xiǎn)評估，準(zhǔn)確認(rèn)知并評估菌株的毒力以及對食品的污染能力等特性至關(guān)重要。

一直以來，單增李斯特菌就被認(rèn)為在菌屬水平上具有致病性，單增李斯特菌的所有分離株均被認(rèn)為具有致病性或者具有潛在的致病性[5]。然而，過去十幾年的研究表明，單增李斯特菌菌株在毒力和致病能力上存在顯著的異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為部分流行菌株有很強(qiáng)的致病力（甚至能致死），而有些菌株（特別是從食品中分離得到的菌株）致病力則非常低[31]。Jensen等[32]的研究指出，臨床分離株的毒性明顯高于魚體分離株，同時，毒力異質(zhì)性與菌株的血清型及溫度也有關(guān)。當(dāng)從冷藏溫度（4 ℃）轉(zhuǎn)到人體溫度（37 ℃）時，血清型為4b的單增李斯特菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，其致病能力高于血清型為1/2a的菌株。單增李斯特菌一共有13 種血清型，而約96%的疾病主要?dú)w因于1/2a、1/2b和4b 3 種血清型菌株，大規(guī)模的中毒事件爆發(fā)大多與血清型為4b的菌株有關(guān)，而一些零星小規(guī)模的中毒事件則多由血清型為1/2a的菌株引起。盡管所有單增李斯特菌菌株都具有致病的主要毒力因素，但不同菌株在進(jìn)行基因表達(dá)時可能存在差異，從而導(dǎo)致了毒力的異質(zhì)性。

沙門氏菌有2 500多種血清型，盡管它們在基因上很相似，但是在流行病學(xué)上卻表現(xiàn)出很大的差異性。這些血清型的差異被認(rèn)為是導(dǎo)致沙門氏菌毒力異質(zhì)性的原因，并且造成了沙門氏菌在臨床上爆發(fā)后的毒力異質(zhì)性。然而，除了不同血清型沙門氏菌表現(xiàn)出了毒力異質(zhì)性以外，相同血清型的菌株也會表現(xiàn)出毒力異質(zhì)性。在Humphrey等[33]進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，兩株血清型為Enteritidis PT4的分離株對熱、酸、H2O2表現(xiàn)出了不同的抵抗能力，其在感染小鼠等動物實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出不同的存活能力。毒性基因常位于毒力島上，對沙門氏菌侵襲宿主細(xì)胞以及發(fā)病病程時間等起到重要作用。因此，菌株毒力的異質(zhì)性是受多因素綜合作用的結(jié)果。

此外，菌株的毒力在不同人群中也表現(xiàn)出異質(zhì)性。單增李斯特菌進(jìn)入人體后是否發(fā)病，與菌株的毒力、宿主的年齡、免疫狀態(tài)有關(guān)。易感者常為新生兒、孕婦及免疫低下的成人，病死率高達(dá)27%～44%[34-35]。阪崎腸桿菌可對各年齡段的人造成入侵性感染，但出生28 d或以下的新生兒和不足2 個月的嬰兒（尤其是早產(chǎn)、低體質(zhì)量和免疫力較弱的嬰兒）的風(fēng)險(xiǎn)最高，兒童和成年人很少感染阪崎腸桿菌[36-38]。

綜上，菌株的毒力主要與菌株本身以及人群有關(guān)。在大多數(shù)微生物風(fēng)險(xiǎn)評估過程中所使用的方法并沒有考慮病原性和毒性的變化，也沒有考慮致病性菌株之間基因型的差異以及明顯的毒力異質(zhì)性。在風(fēng)險(xiǎn)評估的過程中，應(yīng)針對不同的情況，將評估環(huán)境中菌株的毒性變化以及易感人群等因素考慮進(jìn)去。

4 耐藥異質(zhì)性

自抗生素發(fā)現(xiàn)以來，其使用對人類死亡率的降低、預(yù)期壽命的延長等起到了至關(guān)重要的作用。然而，在全球范圍內(nèi)，由于多重耐藥細(xì)菌引起的感染數(shù)量在不斷增加，超級耐藥菌噩夢正逐漸變成現(xiàn)實(shí)，致病菌的抗生素耐藥性已成為對人類健康最大的威脅之一[39-41]。

4.1 菌株耐藥異質(zhì)性

菌株耐藥異質(zhì)性主要可以分為對不同種類抗生素的耐藥性（即單一抗生素耐藥性或多重抗生素耐藥性），以及對同種抗生素耐藥劑量的差異。

圖1 2010—2014年金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌中甲氧西林耐藥株的平均檢出率變化[42-46]Fig. 1 Prevalence of methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus in China in 2010–2014[42-46]

圖1 比較了2010—2014年中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計(jì)的相關(guān)菌株的耐藥性信息[42-46]?？梢钥闯?，同為葡萄球菌屬，金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌對甲氧西林的耐藥性存在較大異質(zhì)性。同時，金黃色葡萄球菌甲氧西林耐藥株和凝固酶陰性葡萄球菌甲氧西林耐藥株對β內(nèi)酰胺類抗生素和其他測試藥的耐藥率均顯著高于金黃色葡萄球菌甲氧西林敏感株和凝固酶陰性葡萄球菌甲氧西林敏感株[42-46]。

沙門氏菌也普遍存在菌株耐藥異質(zhì)性。Cellai等[47]曾對1 267 株來源于9 527 名意大利和西班牙兒童的沙門氏菌進(jìn)行研究。就菌株來源角度分析，從意大利和西班牙分離的沙門氏菌并沒有顯著的耐藥性差異。在所有沙門氏菌中，傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的爆發(fā)率最高。其中，63.7%的鼠傷寒沙門氏菌和31.1%的腸炎沙門氏菌至少對兩種抗生素有耐藥性。在測試的抗生素中，腸炎沙門氏菌對氨芐青霉素和四環(huán)素的耐藥性相對最高，而對頭孢曲松的耐藥性相對最低。另外，Wilson等[48]也有類似關(guān)于沙門氏菌的耐藥異質(zhì)性的報(bào)道。

潘琳等[49]通過對腸球菌的研究表明，腸球菌對不同抗生素的敏感性和耐藥性也不盡相同。不同腸球菌對新霉素的最小抑菌濃度范圍在40～1 280 μg/mL之間，相差近32 倍。

4.2 菌株耐藥機(jī)制異質(zhì)性

細(xì)菌耐藥性已經(jīng)成為人類健康的重要威脅之一。抗生素在養(yǎng)殖過程的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化，并促進(jìn)耐藥性的傳播。耐藥性細(xì)菌通過食物鏈進(jìn)入人體，給公共健康造成了巨大的危害。因此，探究抗生素的耐藥機(jī)制異質(zhì)性具有重要意義。

圖2 菌株耐藥性的機(jī)制[50-51]Fig. 2 Mechanisms of antibiotic resistance in bacteria[50-51]

如圖2所示，菌株抗生素耐藥性主要包括4 種機(jī)制[50-51]，分別為：1）細(xì)胞膜的通透性：細(xì)菌對某些抗生素具有內(nèi)在的抵抗力，因?yàn)榧?xì)胞膜對該抗生素的透過性較低或在細(xì)胞膜表面缺乏抗生素的結(jié)合位點(diǎn)。2）增加外排能力：菌株細(xì)胞膜上的外排泵可將菌體內(nèi)的抗生素泵到細(xì)胞外。許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如細(xì)胞膜上的外排結(jié)構(gòu)，可以將抗生素直接泵到細(xì)胞膜外，而外排泵則會將抗生素泵到細(xì)胞的周質(zhì)空間中。當(dāng)外排泵表現(xiàn)活躍的時候，能使一些在臨床上有效的抗生素失效。有的外排泵具有底物特異性，只泵出一類抗生素，而有的外排泵則能泵出多種結(jié)構(gòu)完全不同的抗生素。3）靶標(biāo)位點(diǎn)突變：通過修飾特定的蛋白質(zhì)，例如改變靶標(biāo)位點(diǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其不能與抗生素結(jié)合，但不改變該蛋白的其他功能。解旋酶的突變就是一個具體的實(shí)例，它能使菌株產(chǎn)生對氟喹諾酮類藥物的耐藥性。RNA聚合酶B亞基突變則會對利福平產(chǎn)生耐藥性。30S核糖體亞基蛋白S12（編碼rpsL）突變，會使菌株對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性。4）抗生素失活：抗生素失活主要有兩種方式，一種是通過對抗生素進(jìn)行共價(jià)修飾使其失活，例如乙酰轉(zhuǎn)移酶催化氨基糖苷類抗生素；另一種是使抗生素直接降解，例如β-內(nèi)酰胺酶降解β-內(nèi)酰胺抗生素。微生物可以通過破壞或修飾抗生素，以阻止抗生素進(jìn)入細(xì)胞或難以和結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合。1940年，隨著青霉素的首次使用，抗生素的酶解修飾便作為抗生素耐藥性的主要機(jī)制，存在于青霉素耐藥菌中。

食源性致病菌中可能同時存在多種耐藥機(jī)制，而最終所表現(xiàn)出的耐藥性是某一種耐藥機(jī)制單獨(dú)作用或幾種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果。食源性致病菌菌株耐藥機(jī)制異質(zhì)性是菌株耐藥異質(zhì)性的根源，其表現(xiàn)為單一或多種抗生素耐藥性異質(zhì)性，以及對一種或幾種抗生素耐藥劑量異質(zhì)性等。菌株耐藥異質(zhì)性的存在增大了風(fēng)險(xiǎn)評估的難度，也對風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生了潛在的威脅。此外，通過對食源性致病菌的耐藥表型和耐藥基因型進(jìn)行分析，并采用數(shù)學(xué)模型研究耐藥基因的轉(zhuǎn)移規(guī)律，開展食源性致病菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評估，有助于從“風(fēng)險(xiǎn)”的角度解釋其耐藥性形成的機(jī)制，從而有效控制耐藥性食源性致病菌對人類健康帶來的風(fēng)險(xiǎn)[52]。

5 菌株多相異質(zhì)性在風(fēng)險(xiǎn)評估中的展望

菌株多相異質(zhì)性提出的初期，很多微生物學(xué)家認(rèn)為菌株之間的多相異質(zhì)性等于或者小于實(shí)驗(yàn)異質(zhì)性[53]，對評估結(jié)果影響不大，因此可以不把微生物菌株多相異質(zhì)性考慮到風(fēng)險(xiǎn)評估過程中。此觀點(diǎn)一直被廣泛接受，直到Delignette-Muller等[54]提出，微生物菌株多相異質(zhì)性對風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果有很大的影響。為了提高風(fēng)險(xiǎn)評估的準(zhǔn)確性，2007年食品法典委員會提出，通過科學(xué)的技術(shù)手段最大程度地將菌株多相異質(zhì)性在風(fēng)險(xiǎn)評估中量化表達(dá)[55]。為了使風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果能夠更可靠，充分地了解影響風(fēng)險(xiǎn)評估準(zhǔn)確性的因素是必需的。然而，雖然這個觀點(diǎn)很早就被提出來，但菌株多相異質(zhì)性是菌株間的固有差異性，不能通過增加實(shí)驗(yàn)次數(shù)或者改變實(shí)驗(yàn)方法等傳統(tǒng)方法來降低，因此至今依舊難以實(shí)現(xiàn)。

菌株在表型、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)和代謝功能3 個方面均會表現(xiàn)出異質(zhì)性。Koutsoumanis等[6]綜述了食品預(yù)測微生物學(xué)中的菌株異質(zhì)性，強(qiáng)調(diào)了基因表達(dá)的異質(zhì)性是導(dǎo)致菌株表型異質(zhì)性更深層次的原因，蛋白質(zhì)和代謝功能異質(zhì)性會直接調(diào)控基因表達(dá)的異質(zhì)性。本文聚焦表型異質(zhì)性的4 個方面：生長和失活異質(zhì)性、生物被膜形成異質(zhì)性、毒力異質(zhì)性、耐藥異質(zhì)性，并探索食源性致病菌菌株多相異質(zhì)性對風(fēng)險(xiǎn)評估的影響。考慮到異質(zhì)性對微生物風(fēng)險(xiǎn)評估的重要性，表型異質(zhì)性、基因表達(dá)異質(zhì)性、蛋白質(zhì)和代謝功能異質(zhì)性應(yīng)該被整體考慮到預(yù)測微生物模型中[6]。在過去的25 年里，微生物風(fēng)險(xiǎn)評估技術(shù)發(fā)展迅猛。最初，風(fēng)險(xiǎn)評估技術(shù)被有效地應(yīng)用于評估化學(xué)和工程等方面的風(fēng)險(xiǎn)。相較于前面兩者，由于食源性致病菌菌株多相異質(zhì)性等因素的存在，其在食品安全領(lǐng)域的運(yùn)用更具挑戰(zhàn)性。針對風(fēng)險(xiǎn)評估過程難以整合菌株多相異質(zhì)性的問題，建議主要通過4 個方面進(jìn)行改進(jìn)。

5.1 基因網(wǎng)絡(luò)識別技術(shù)

基因網(wǎng)絡(luò)識別技術(shù)結(jié)合了數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)開源數(shù)據(jù)分析軟件，常被用于系統(tǒng)遺傳學(xué)研究。該技術(shù)中的數(shù)據(jù)集由大量的基因型和表型構(gòu)成。通過存儲的數(shù)據(jù)集信息與個體菌株的基因型作對比，繪制出基因圖譜，從而發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)、細(xì)胞功能和個體行為等方面的差異，并將這些差異與健康和疾病風(fēng)險(xiǎn)的差異聯(lián)系起來。該技術(shù)能提高微生物風(fēng)險(xiǎn)評估中的毒力基因預(yù)測以及微生物危害特征描述的準(zhǔn)確性，因此被認(rèn)為是一種較為有效的方法。

5.2 系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)

系統(tǒng)生物學(xué)旨在以數(shù)學(xué)定量的方式整合生物學(xué)信息[56]，包括基因組測序、全基因組轉(zhuǎn)錄分析、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等。在進(jìn)行微生物風(fēng)險(xiǎn)評估時，由于對劑量反應(yīng)方程缺乏系統(tǒng)性的認(rèn)知，使得危害特征描述成為評估過程中較為困難的一個環(huán)節(jié)。這個技術(shù)的困難之處在于難以進(jìn)行志愿性的人體實(shí)驗(yàn)研究，并且在疫情爆發(fā)時難以找到替代劑量反應(yīng)方程的方法。在過去的數(shù)十年間，系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)在主要食源性致病菌（沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌等）的應(yīng)用，進(jìn)一步地提升了對微生物劑量反應(yīng)方程的認(rèn)知。此外，通過對同一種屬的菌株進(jìn)行基因組測序，比較不同菌株的基因組序列，可以準(zhǔn)確地評估菌株的異質(zhì)性，促進(jìn)菌株多相異質(zhì)性在劑量反應(yīng)方程中的量化表達(dá)。

5.3 優(yōu)化的隨機(jī)模型

預(yù)測微生物學(xué)建模是食品微生物風(fēng)險(xiǎn)評估的重要方法，常用的風(fēng)險(xiǎn)評估模型分為確定性模型和隨機(jī)性模型。大部分的確定性模型通過點(diǎn)估計(jì)進(jìn)行模型擬合，方程中的參數(shù)常為確定性參數(shù)，對特定實(shí)驗(yàn)條件下的結(jié)果進(jìn)行擬合，無法考慮菌株多相異質(zhì)性等因素。因此，很多學(xué)者質(zhì)疑此類方程在微生物風(fēng)險(xiǎn)評估以及食品安全管理上是否已失效。而部分隨機(jī)模型例如蒙特卡羅模型、貝葉斯方程以及泊松分布等能夠描述并將微生物的生長異質(zhì)性整合到模型中，從而考慮到整個風(fēng)險(xiǎn)評估過程[57]。2005年，Barker等[58]將肉毒梭狀芽孢桿菌孢子的延滯期異質(zhì)性整合到了貝葉斯方程中。2017年，Koyama等[19]用泊松分布擬合了菌株的失活異質(zhì)性。結(jié)果表明，泊松分布可以描述細(xì)菌失活過程中的異質(zhì)性。能夠擬合菌株多相異質(zhì)性的隨機(jī)模型在風(fēng)險(xiǎn)評估領(lǐng)域越來越重要。

5.4 宏模型

本實(shí)驗(yàn)室針對菌株多相異質(zhì)性創(chuàng)新性地提出建立風(fēng)險(xiǎn)評估宏模型的方法。宏模型是在一級、二級和三級模型的基礎(chǔ)上建立菌株多相異質(zhì)性數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，通過引入超級參數(shù)實(shí)現(xiàn)整合菌株多相異質(zhì)性的超級模型。它以建立菌株多相異質(zhì)性數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，收集國內(nèi)外研究中菌株多相異質(zhì)性的相關(guān)數(shù)據(jù)，按菌株異質(zhì)性的類型、菌株的種類、評估食品的種類以及評估的環(huán)境條件等進(jìn)行分類。在進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估時，針對數(shù)據(jù)庫中相關(guān)某一類或某幾類異質(zhì)性數(shù)據(jù)進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，得出異質(zhì)性的總體趨勢，進(jìn)而擬合得到帶有不確定參數(shù)的子模型。無數(shù)個帶有不確定參數(shù)的子模型最終構(gòu)成含超級參數(shù)的宏模型。在處理具體的菌株異質(zhì)性問題時，通過輸入環(huán)境條件參數(shù)、評估食品的類型等相關(guān)信息即可獲得系統(tǒng)給予的、在該評估環(huán)境下有效的、帶有不確定參數(shù)的系列子模型，將該模型運(yùn)用于實(shí)際的微生物風(fēng)險(xiǎn)評估過程，最終獲得整合菌株多相異質(zhì)性的風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果。

以上4 種方法的應(yīng)用均能在一定程度上將菌株多相異質(zhì)性整合到風(fēng)險(xiǎn)評估過程中。但到目前為止，由于菌株多相異質(zhì)性的復(fù)雜性，依然需要更進(jìn)一步的研究，通過改進(jìn)以上4 種方法或者提出更多、更好的方法，使得菌株多相異質(zhì)性能最大可能地在風(fēng)險(xiǎn)評估過程中有序地體現(xiàn)出來。因此，將各類菌株多相異質(zhì)性有序的量化到風(fēng)險(xiǎn)評估過程仍需要進(jìn)行大量的科研投入。

6 結(jié) 語

食源性致病菌是當(dāng)今食品安全的重大威脅，菌株多相異質(zhì)性是食源性致病菌的固有特性，對微生物風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大影響。然而，國內(nèi)開展食源性致病菌菌株多相異質(zhì)性的相關(guān)研究依然較少。因此，針對我國國情，科學(xué)系統(tǒng)地開展微生物風(fēng)險(xiǎn)評估，是每個食品微生物風(fēng)險(xiǎn)評估人員以及國家風(fēng)險(xiǎn)評估中心的共同職責(zé)?；虮磉_(dá)的異質(zhì)性是導(dǎo)致菌株間表型異質(zhì)性的主要根源。在更深入的研究中，除了考慮菌株表型的異質(zhì)性以外，也要逐漸將更多的目光放到基因型、蛋白質(zhì)組和代謝產(chǎn)物等的異質(zhì)性中。另外，除了菌株多相異質(zhì)性之外，其他的影響因素例如產(chǎn)品特性、食品供應(yīng)鏈的溫度和時間、消費(fèi)者行為等都會對定量微生物風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果有很大的影響，也應(yīng)該引起風(fēng)險(xiǎn)評估人員的重視。盡可能多地將異質(zhì)性和生產(chǎn)中的不確定性考慮到風(fēng)險(xiǎn)評估過程，對食品風(fēng)險(xiǎn)防控措施和食品安全目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)、進(jìn)一步保障國內(nèi)公眾衛(wèi)生具有重大意義。