非培養(yǎng)方法研究榨菜中酵母菌的多樣性

燕平梅，邢勇，李娜，趙文婧，陳燕飛，喬宏萍

(1.太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，太原 030619)

榨菜越來越多地出現(xiàn)在人們的餐桌上，它是一種以莖用芥菜為原料腌制而成的半干態(tài)非發(fā)酵性咸菜，它質(zhì)地脆嫩、風(fēng)味鮮美、營養(yǎng)豐富，具有一種特有的風(fēng)味，具有特殊的酸味和咸鮮味，富含豐富的人體所必需的蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、膳食纖維、礦物質(zhì)等以及谷氨酸、天門冬氨酸、丙氨酸等17種游離氨基酸，可以佐餐、炒菜、做湯，深受人們喜愛。在榨菜腌制過程中，酵母菌發(fā)揮了不可或缺的作用，可以將榨菜中的物質(zhì)分解成人體易吸收的有益物質(zhì)，通過研究榨菜中酵母菌的多樣性可以了解哪些種屬發(fā)揮的作用較大，然后通過人工添加相關(guān)菌種來促進(jìn)榨菜的腌制。

本實(shí)驗(yàn)中，研究榨菜中酵母菌的多樣性采用的是非培養(yǎng)的方法即PCR-DGGE技術(shù)，如今DGGE技術(shù)已經(jīng)成為研究微生物群落及親緣關(guān)系的主要分子工具之一[1，2]，它具有不需要通過培養(yǎng)就可以進(jìn)行分析序列的優(yōu)點(diǎn)，可以大大地縮短樣品分析的時(shí)間，減少工作量，也已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食品(包括腌制蔬菜)微生物的研究中[3，4]。DGGE技術(shù)是通過聚丙烯酰氨凝膠中變性劑濃度的不同，將不同序列DNA分開，之后通過凝膠成像儀得到DGGE圖譜，通過DGGE圖譜上的條帶[5，6]，達(dá)到了解微生物的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模偻ㄟ^對(duì)DGGE圖譜的分析，從而了解其種群特征及多樣性[7]。

榨菜在我國擁有悠久的加工歷史，并且由于其本身爽口的特點(diǎn)以及方便性，越來越深受人們喜愛，通過對(duì)榨菜進(jìn)一步分析得知，不僅食材本身具有特殊性，其中微生物發(fā)酵對(duì)其口感也有影響，隨著對(duì)榨菜中微生物群落的多樣性研究越來越詳細(xì)，人們對(duì)口感的改善也有了更豐富的經(jīng)驗(yàn)，其中楊珺等[8]、李正國等[9]、燕平梅等[10]分別通過微生物的分離培養(yǎng)、傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與DGGE技術(shù)結(jié)合、PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)榨菜發(fā)酵過程中的微生物種類、榨菜腌制過程中的細(xì)菌多樣性以及榨菜中的乳酸菌群落進(jìn)行了相關(guān)的研究，對(duì)細(xì)菌等微生物給出了參考。但是由于對(duì)榨菜中的真菌研究較少，故為了進(jìn)一步探索榨菜中的真菌多樣性，本文通過PCR-DGGE技術(shù)對(duì)市售的袋裝榨菜進(jìn)行了研究，進(jìn)一步了解了榨菜中的真菌(以酵母菌為研究對(duì)象)群落的多樣性[11]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

爽口榨菜400 g，用SZ表示，其成分為：榨菜、食用鹽、辣椒、香辛料、食品添加劑(苯甲酸鈉、檸檬黃)；

烏江榨菜70 g，用WZ表示，其成分為：榨菜、食用鹽、植物油、食品添加劑(谷氨酸鈉、5-呈味核苷酸二鈉、安賽蜜、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉)、辣椒、發(fā)酵醬油粉(釀造醬油、麥芽糊精、食用鹽)。

1.1.2 主要試劑及儀器

試劑：血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、TAE緩沖液、 溴化乙錠、NLI-GC(引物)、 LS2(引物)、瓊脂糖(生化試劑)、無菌水、PCR Master Mix、丙烯酰胺、TAE buffer、TEMED、去離子甲酰胺、過硫酸銨、尿素、凝膠加樣緩沖液、氫氧化鈉、甲醛、冰醋酸、無水乙醇、硝酸銀。

儀器：離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、DYY-6C型電泳儀、電泳槽、紫外分光光度計(jì) 美國Bio-Rad公司；無菌手術(shù)刀、YXQ-LS-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器、水浴鍋。

1.2 榨菜中微生物的DNA提取

從兩種榨菜中各取榨菜汁18 mL于8000 r/min離心5 min，倒掉上清液，將菌種收集到離心管中，然后根據(jù)血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)的說明步驟提取DNA，最后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果。

1.3 酵母菌的PCR擴(kuò)增

以酵母菌的DNA為模板，引物為酵母菌的DNA擴(kuò)增的通用引物(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)：

NL1-GC:cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g；

LS2:att ccc aaa caa ctc gac tc；

PCR的反應(yīng)體系為：PCR Master Mix 12.5 μL，NL1-GC 1 μL，LS2 1 μL，無菌水9 μL，樣品DNA 1.5 μL。

PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,46 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,設(shè)置30個(gè)循環(huán)。

PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL，通過瓊脂糖凝膠電泳，觀察DNA電泳結(jié)果。

1.4 酵母菌PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳(DGGE)

變性梯度凝膠的配方見表1。

表1 變性梯度凝膠的配方Table 1 The formula of denatured gradient gel

DGGE電泳后凝膠于Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照。將每條可看到的電泳帶切割回收，溶膠后作為模板通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增16S rDNA V7-V8片段，純化后與pGM-T Vector進(jìn)行連接， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將檢測(cè)陽性克隆的送至華大基因公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.5 DGGE圖譜分析

將DGGE電泳片段放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察并讀取圖譜，用Quantity One Software 對(duì)DGGE圖譜中條帶的亮度、位置、面積等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)分析結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后根據(jù)Microsoft Excel軟件計(jì)算多樣性指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(E)及豐富度指數(shù)(R)。

其中相關(guān)生態(tài)指數(shù)計(jì)算公式為：

H=-∑Pilog2Pi；

E=1-∑Pi2；

R=S-1/InN。

式中：Pi為Relative Qty值/100，N為某一泳道所有峰面積，S為某一泳道的總條帶數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 榨菜中微生物DNA提取結(jié)果

圖1 榨菜中微生物DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 Fig.1 The result of microbial DNA in pickles by agar gel electrophoresis

注：圖中1,2 表示爽口榨菜，3，4表示烏江榨菜。

DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中，條帶表示是否具有DNA，亮度表示其含量的多少。由圖1可知，在4個(gè)泳道中都有亮點(diǎn)，說明提取到了DNA，但是由于亮度較暗，說明DNA含量較少。

2.2 酵母菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2中左邊第一條條帶為marker，其后4條條帶為酵母菌DNA，從左往右依次為SZ、SZ、WZ、WZ，根據(jù)Marker可知擴(kuò)增后酵母菌DNA分子量為400 bp，可以進(jìn)行DGGE分析。

圖2 酵母菌DNA PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoresis figure of Saccharomycetes DNA

2.3 酵母菌PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳

榨菜酵母菌的DGGE電泳圖見圖3。

圖3 DGGE電泳圖譜Fig.3 DGGE electrophoresis

圖3中SZ為爽口榨菜，WZ為烏江榨菜，圖中條帶的多少說明酵母菌種群的多樣性，不同位置的條帶說明酵母菌種屬不同，條帶的亮度表明酵母菌的豐富度[12，13]。爽口榨菜有兩條不同變性濃度的條帶，說明爽口榨菜中有兩種不同的酵母菌，烏江榨菜中也有兩種不同的酵母菌，但是爽口榨菜(SZ)中的第一條條帶與烏江榨菜(WZ)中的第一條條帶的變性濃度相同，說明這兩條條帶為同一種酵母菌。

2.4 DGGE圖譜結(jié)構(gòu)多樣性分析

表1 榨菜中酵母菌多樣性分析Table 1 Analysis of the diversity of Saccharomycetes in pickles

由表1可知，樣品SZ(即爽口榨菜)中的酵母菌多樣性指數(shù)與豐富度都比樣品WZ(即烏江榨菜)中的數(shù)值大，均勻度卻比樣品WZ小。

2.5 聚類分析結(jié)果

圖4 樣本聚類分析結(jié)果Fig.4 Sample cluster analysis results

圖4中#1代表SZ，#2代表WZ，#3為空白位置，不帶有任何序列，根據(jù)聚類分析結(jié)果可知，SZ與WZ的相似性為0.60，說明在兩種榨菜中，酵母菌的相似性較大。

2.6 基因測(cè)序分析結(jié)果

表2 DGGE序列測(cè)序分析結(jié)果Table 2 Sequencing analysis results of DGGE sequences

編號(hào)SZ1代表爽口榨菜(SZ)DGGE圖譜中的第一條條帶，SZ2代表SZ中的第二條條帶，WZ2代表烏江榨菜(WZ)中的第二條條帶，由DGGE圖譜可知WZ中的第一條條帶與SZ1的變性濃度相同，可知為同一種酵母菌。由表2可以得出在NCBI中具有最高同源性的菌株，這有助于進(jìn)一步準(zhǔn)確確定其序列所屬的菌種，將測(cè)序結(jié)果使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，見圖5。

2.7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 DNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 DNA sequence phylogenetic tree

由圖5可知，條帶SZ2與條帶WZ2有較近的親緣關(guān)系，相似度為93%；SZ2的相似菌種Candidatropicalis與WZ2的相似菌種Saturnisporamendonce的親緣關(guān)系較近，相似度高達(dá)98%；條帶生長(zhǎng)SZ2與條帶SZ1親緣關(guān)系較差，相似度只有57%，由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，兩種榨菜樣品中含有的酵母菌可能與Candidatropicalis，Pichiafermentans，Saturnisporamendonce這3種菌有較高的相似性。

3 討論

榨菜作為一種非發(fā)酵腌制食品，其中微生物種類豐富，越來越多的學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入研究，楊珺等在《四川榨菜后熟時(shí)期微生物區(qū)系的研究》中探索了其中細(xì)菌及真菌的優(yōu)勢(shì)種類，得出酵母菌有5個(gè)屬，具體確定到種時(shí)為3種酵母菌，但是采用的方法為培養(yǎng)的方法，相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)采用的PCR-DGGE非培養(yǎng)方法較為麻煩，本實(shí)驗(yàn)通過PCR-DGGE技術(shù)分析序列直接得知樣品中酵母菌的種類。隨后學(xué)者李正國對(duì)于研究榨菜中微生物多樣性的方法進(jìn)行了前沿性探索，實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)方式及PCR-DGGE技術(shù)相結(jié)合的方法，得到了榨菜發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為明串珠菌屬，其次為乳酸菌，雖然研究方法有了突破，但是研究的只是榨菜中細(xì)菌種類的多樣性，沒有涉及到真菌的研究，本文在其基礎(chǔ)上發(fā)展到對(duì)真菌的研究，在方法上只采用非培養(yǎng)PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行研究[14]，本文以兩種市售榨菜為研究對(duì)象，對(duì)榨菜中的酵母菌多樣性進(jìn)行了探索，由DGGE圖譜分析可知，酵母菌的種類含量較多，對(duì)于榨菜具有舉足輕重的作用。而DGGE技術(shù)檢測(cè)極限低，并且可以同時(shí)快速分析多個(gè)樣品，能清楚、準(zhǔn)確地反映樣品間微生物群落的差異性及其多樣性，并且可以將條帶切割下來測(cè)序，可以說這是分析微生物群落多樣性及其差異性最為廣泛的工具之一[15]。本文得出的酵母菌種類與楊珺等人分析得出的酵母菌種類不同，不僅由于其樣本不同，可能還與DGGE分析有關(guān)，根據(jù)DGGE技術(shù)的原理可知，在同一位置上DNA序列是相同的，但是，由于異源雙鏈體[16]、嵌合體、共遷移等會(huì)導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差。在實(shí)驗(yàn)操作中還應(yīng)認(rèn)真仔細(xì)，減少其不必要的誤差，如：DGGE電泳過程中的染色，應(yīng)采用效果好且不與其他物質(zhì)相影響的染色劑；還有在使用Quantity One軟件時(shí)應(yīng)盡量減少偏差的出現(xiàn)，使其可以準(zhǔn)確地體現(xiàn)出條帶的信息，這樣做出的實(shí)驗(yàn)及得出的結(jié)論才可以有更高的精確性及說服力。所以可以采用其他方法，如原位雜交、克隆、分離培養(yǎng)等技術(shù)相結(jié)合使用進(jìn)行分析，這樣可以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性[17]。