利用熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR檢測豬瘟活疫苗（細胞源）中的16種外源病毒

孫博 宋新剛 張萌萌 張健 高習(xí)文 張立恒 尹輝 郭偉 任德強

摘要：本文為分子生物學(xué)方法檢測豬瘟活疫苗（細胞源）外源病毒提供實驗數(shù)據(jù)。用經(jīng)過驗證的熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR方法檢測哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的24批豬瘟活疫苗（細胞源）中的16種外源病毒（FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1），結(jié)果顯示24批豬瘟活疫苗（細胞源）成品均無以上16種外源病毒。

關(guān)鍵詞：豬瘟活疫苗;PCR;RT-PCR;外源病毒

中圖分類號：S852.4文獻標(biāo)識碼：A文章編號：2095-9737（2019）01-0001-04

Abstract：It provides experimental data for the determination of classical live swine fever vaccine（cell source） exogenous virus by molecular biology method.Detection of 16 exogenous viruses （FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1） from 24 batches of live classical swine fever vaccine（cell source） produced by Harbin Yuanheng Biopharmaceuticals Co. Ltd.， the results showed that 24 batches of products did not have the above 16 exogenous viruses.

Key words：Living classical swine fever vaccine; PCR; RT-PCR; Exogenous virus

外源病毒的干擾，已經(jīng)成為疫苗質(zhì)量問題的隱形殺手，豬瘟活疫苗（細胞源）的外源病毒檢測一項，參照《中華人民共和國獸藥典》（2015年版第三部）要求，需要做熒光抗體檢測、致細胞病變和紅細胞吸附實驗[1]，以下簡稱細胞培養(yǎng)法。哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，致力于生產(chǎn)行業(yè)內(nèi)最純凈的疫苗，并始終關(guān)注檢測方法的研究，希望通過有效的檢測手段，合理、高效的保證產(chǎn)品質(zhì)量。

哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司采購了14種熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR商品化試劑盒，試劑盒分別經(jīng)過特異性、敏感性、重復(fù)性方法學(xué)驗證[2-14]，檢驗方法已完成驗證?，F(xiàn)用經(jīng)過驗證的熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR商品化試劑盒檢測24批豬瘟活疫苗（細胞源）中的16種外源病毒（FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1），以期為分子檢測方法提供臨床數(shù)據(jù)便于試驗分析及在生產(chǎn)過程中有針對性的防止外源病毒污染。

1 材料與方法

1.1 材料

分子檢測試劑盒：豬細小病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，豬偽狂犬病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，豬圓環(huán)病毒1型實時熒光PCR檢測試劑盒，豬圓環(huán)病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒，牛皰疹病毒Ⅰ型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，口蹄疫病毒通用型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，豬瘟病毒野毒株實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，牛冠狀病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，牛病毒性腹瀉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，豬日本乙型腦炎病毒實時熒光RT-PCR 檢測試劑盒，豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒三重實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，牛副流感病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，哺乳動物呼腸孤病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒（以上材料采購自TaKaRa、Promega、青島巴特菲生物科技有限公司、北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司）。

哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司連續(xù)生產(chǎn)的24個批次豬瘟活疫苗（細胞源）每批3瓶。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測系統(tǒng)FQD-96A（購自杭州博日科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取

每批豬瘟活疫苗（細胞源）3瓶，用生理鹽水稀釋至完全溶解后混合，根據(jù)批號依次排列順序并標(biāo)記序號。參照試劑盒說明書，進行核酸提取。

1.2.2 擴增

核酸提取后擴增前將試劑盒從-20℃拿出，將試劑混勻后離心待用，每種試劑盒檢測26份樣品，分別為24批樣品、陰性對照、陽性對照，每種檢測項目配制27份體系，提取后的核酸根據(jù)說明書要求的程序進行擴增，觀察曲線，并記錄CT值。PCR儀可以同時檢測96份樣品，選取三種外源病毒進行同時擴增，F(xiàn)MDV、PCV2、CSFVW為1組，BCoV、BVDV、BPIV-3為1組，PCV1、MRV、JEV為一組，TGEV、PEDV、RV、PRRSV為1組， PPV、PRV、BHV-1為1組，共進行五次擴增，TGEV、PEDV、RV、PRRSV組樣品數(shù)量為52個，其余每組樣品數(shù)量為78個。根據(jù)說明書在軟件上輸入不同病毒核酸的擴增程序，經(jīng)過連續(xù)檢測直到所有外源病毒檢測項目完畢后進行結(jié)果統(tǒng)計。

2 結(jié)果

16種外源病毒陽性CT值符合結(jié)果判定要求，并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰陽性對照成立，24批豬瘟活疫苗（細胞源）結(jié)果為陰性。CT值參見表1，陽性對照擴增曲線參見圖1～圖5。

3 討論

疫苗品質(zhì)是優(yōu)良產(chǎn)品的精髓，我們從原材料、硬件設(shè)施、生產(chǎn)流程三個層面嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，不斷苛求純凈的產(chǎn)品品質(zhì)。豬瘟活疫苗（細胞源）的制備選用的原材料為細胞、胰酶、牛血清等，根據(jù)原材料動物種屬的不同，選取豬源及牛源相關(guān)的常見外源病毒作為檢測項目（FMDV、PCV2、BCoV、BVDV、BPIV-3、TGEV、PEDV、RV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1）。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)先進檢測技術(shù)，從細胞、血清、胰酶到半成品、成品依次進行檢測，以加強外源病毒的監(jiān)測及對外源病毒的來源進行追溯。同時為了保證抗原品系純正，選取豬瘟病毒疫苗毒和野毒株熒光RT-PCR檢測試劑盒分別進行疫苗毒和野毒的雙向檢測，保證疫苗無野毒污染的同時，確保疫苗品系“純正”。在生產(chǎn)流程方面，為了避免產(chǎn)品間的交叉污染，增加高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（JXA1-R株）分子生物學(xué)方法檢測外源病毒項。

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2015年版第三部外源病毒檢測法，針對豬瘟活疫苗（細胞源）用非禽源細胞來源及疫苗靶動物，選用的細胞為MDBK、Vero、PK-15[15]，分別進行實驗。如果在細胞培養(yǎng)法結(jié)果出現(xiàn)陽性時，我們可以用已建立的分子生物學(xué)方法檢測細胞培養(yǎng)法所使用的原材料，包括MDBK、Vero、PK-15、牛血清、胰酶的檢測，以排除實驗過程中引入的外源病毒，保證細胞培養(yǎng)法實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

細胞培養(yǎng)法和分子生物學(xué)檢測法兩者相比較，除去原材料及設(shè)備設(shè)施的不同，檢驗周期也有很大差別。分子生物學(xué)方法可以快速、靈敏的檢出外源病毒陽性，如果分子檢測方法檢出陽性，在不能確定是否為假陽性的情況下，則需要對該樣品進行基因測序[16]，同時該樣品接種相對應(yīng)的細胞，繼代兩次后再進行PCR檢測，進一步驗證實驗結(jié)果，避免誤判。

雖然我國2015年版獸藥典未收錄分子生物學(xué)檢測方法，但在國際貿(mào)易指定試驗中PCR方法已經(jīng)廣泛使用。如OIE（世界動物衛(wèi)生組織） 已將檢測藍舌病病毒（BTV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV） 等病毒的PCR方法列為國際貿(mào)易指定試驗方法[17]。因此細胞培養(yǎng)法只能確定是否有外源病毒污染，而分子生物學(xué)方法可以確定被污染的外源病毒的種類，根據(jù)檢測結(jié)果，生產(chǎn)過程中可以進行有針對性的控制[18]，從而保證產(chǎn)品的安全性。熒光定量PCR和熒光定量RT-PCR方法操作便捷、快速、直觀，可以作為細胞培養(yǎng)法檢測外源病毒的有效補充，鑒定疫苗的純凈性并根據(jù)污染的外源病毒種類指導(dǎo)生產(chǎn)。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國獸藥典[M].2015（第三部）.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：附錄16-18.

[2] 李永東，張常印，姜平，等.口蹄疫病毒實時RT-PCR檢測方法的建立[J].中國人獸共患病學(xué)報，2006（03）.

[3] 張福良，朱道中，宋長緒.豬圓環(huán)病毒I型熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)雜志，2008（01）.

[4] 曹偉偉，郭抗抗，許信剛，等.豬圓環(huán)病毒Ⅱ型TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013（01）：41（1）13-18.

[5] 趙麗，趙旭永，陳紅英，等.PPV SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012（05）.

[6] 李雪明，于紅欣，楊紅杰，等.偽狂犬病病毒gE基因熒光定量PCR檢測方法的建立[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2015（04）.

[7] 許夢怡.豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒多重?zé)晒釸T-PCR檢測方法的建立[D].揚州大學(xué)，2016.

[8] 陽帆，劉建軍，何建凡，等.TaqMan PCR檢測乙型腦炎病毒方法的建立及應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008（10）.

[9] 季新成，牛國輝，員麗娟，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒內(nèi)標(biāo)熒光定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2010（06）.

[10]??? Mohit Baxi，Dorothy McRae，Shailja Baxi，et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses[J] .Veterinary Microbiology，2006 （1） .

[11]??? Haitham M. Amer，F(xiàn)ahad N. Almajhdi，et al. Development of a SYBR Green I based real-time RT-PCR assay for detection and quantification of bovine coronavirus[J] . Molecular and Cellular Probes ， 2011 （2） .

[12]??? Toussaint J F，Rziha H J，Bauer B，et al.Effects of hypervaccination with bovine herpesvirus type 1 gE-deleted marker vaccines on the serological response and virological status of calves challenged with wild-type virus.[J] .Veterinary Record ，2004 .

[13]??? 蒲靜，賴平安，張鶴曉，等.高致病性豬藍耳病病毒TaqMan熒光RT-PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用[A].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C].2008.

[14]??? 張興娟.同時檢測和區(qū)分豬瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹瀉病毒1型的三重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立[D].揚州大學(xué)，2010.

[15]??? 吳華偉，郎洪武，陳曉春，等.《中華人民共和國獸藥典》二〇一〇年版三部非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗解讀[J].中國獸藥雜志，2013，47（1）：48-52.

[16]??? 尚宏華，郭建平，謝秋梅.豬瘟活疫苗外源病毒BVDV細胞培養(yǎng)與PCR檢測的比較[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2014（6）：8-10.

[17]??? 世界動物衛(wèi)生組織.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊（哺乳動物、禽鳥與蜜蜂）第五版[S].

[18]??? 王彩霞.幾種方法對非禽源生物制品中外源病毒檢測的研究[D].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.