響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻超聲波破壁技術(shù)

郭鎖蓮 廉想 于雪

摘要 小球藻營(yíng)養(yǎng)豐富且全面，具有重要的生理功能和保健功效，在營(yíng)養(yǎng)品、保健品、功能食品方面具有良好的應(yīng)用前景。然而，由于小球藻的細(xì)胞壁十分堅(jiān)硬，破碎困難，胞內(nèi)的有效成分不易釋放，抑制了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，一種安全有效的破壁方法是小球藻產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵。該研究采用超聲波破壁技術(shù)處理小球藻，通過單因素試驗(yàn)考察超聲時(shí)間、超聲波功率、料液比對(duì)細(xì)胞破碎的影響，并進(jìn)一步采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化其工藝參數(shù)。結(jié)果表明：通過單因素試驗(yàn)得到破壁效果的影響力大小依次為超聲時(shí)間、超聲波功率、料液比。Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化的工藝條件為料液比1∶200（g∶mL）、超聲波功率為450 W、超聲時(shí)間為15 min。該條件下細(xì)胞破壁率為79.51%，與模型預(yù)測(cè)值80%非常接近。采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波破碎藻細(xì)胞條件進(jìn)行優(yōu)化合理可行。

關(guān)鍵詞 小球藻;超聲波;破壁;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào) S-3 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.049

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract Chlorella has been applied in many fields，for its rich，allround and balanced nutrition.The cell wall of Chlorella is very hard to crush，so that the activate component in the cell is difficult to release.Then，industrialization development for Chlorella is restricted.Therefore，a safety and effective method to break cell is the key technology in Chlorella industry.Ultrasound technology was adopted to break Chlorella cell in this study.In order to obtain the optimum parameters of ultrasound technology，the effects of several factors including solidliquid ratio，ultrasonic power and process time on the breaking were investigated by using a single factor experiment and further optimized by using BoxBehnken experiment and response surface methodology （RSM）.The results showed that process time had the most important influence on cellbreakage and it was followed by ultrasonic power ，solidliquid radio in the effects.The optimal condition of cellbreakage was obtained，that was，solidtoliquid ratio of 1∶200，ultrasonic power of 450 W and process time of 15 min.The cell breaking rate was 79.51% under those conditions，which perfectly matched the predicted value （80%）.Therefore，it is feasible that utilizing RSM to optimize the conditions of cellbreakage.

Key words Chlorella sp.;Ultrasound wave;Cellbreakage;Response surface methodology

小球藻（Chlorella sp.）隸屬于綠藻綱綠球目卵囊藻科小球藻屬，是普生性真核單細(xì)胞綠藻。小球藻營(yíng)光合自養(yǎng)，是初級(jí)生產(chǎn)力，處于食物鏈的最低端，具有分布廣泛[1]、生長(zhǎng)周期短、繁殖快等優(yōu)點(diǎn)，成為第一種被人工養(yǎng)殖的微藻，在美國(guó)、日本等國(guó)已有30多年的養(yǎng)殖歷史[2]。

小球藻營(yíng)養(yǎng)豐富，胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、色素和維生素，其中必需氨基酸、必需脂肪酸的組成全面，配比均衡，且無毒副作用，作為保健食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料、畜牧飼料添加劑得到廣泛應(yīng)用[3-4]。不僅如此，小球藻在污水處理[5-6]、CO2減排[7]，以及生物能源[8-9]的開發(fā)利用方面都在世界范圍內(nèi)引起了廣泛重視。

小球藻因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、無毒害作用，被認(rèn)為是開展生物技術(shù)研究的良好材料[10]，它可以作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等基因工程產(chǎn)品[11]。但是由于小球藻細(xì)胞壁成分復(fù)雜，質(zhì)地堅(jiān)韌[12]，給胞內(nèi)有效成分的獲取造成了一定的困難，從而影響了小球藻相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用和推廣 [13-14]。

為了尋找一種安全有效的破壁方法，筆者主要通過超聲波破碎技術(shù)對(duì)小球藻進(jìn)行破壁處理，考察了單因素料液比、超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)破壁效果的影響。通過響應(yīng)曲面模型對(duì)小球藻的超聲波破壁工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在尋找最佳的操作條件。

1 材料與方法

1.1 材料 小球藻藻種，由煙臺(tái)富生科技有限公司提供。

1.2 設(shè)備與儀器 生物顯微鏡（上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司）;分析電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)。

固定條件：超聲波功率為500 W，處理時(shí)間20 min，料液比1∶200 （g∶mL），改變單一因素，考察其對(duì)小球藻細(xì)胞破碎率的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

破碎率=[（原始細(xì)胞個(gè)數(shù)-破碎處理后剩余的細(xì)胞個(gè)數(shù)）/原始細(xì)胞個(gè)數(shù)]×100%

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲破壁技術(shù)。

根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3因素3水平試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素和水平見表1，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。針對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Design-Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化工藝條件，確定最優(yōu)的料液比、超聲功率、超聲時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲破壁影響因素確定

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)細(xì)胞破碎率的影響。

固定料液比、超聲波功率等條件，研究不同超聲時(shí)間對(duì)細(xì)胞破碎率的影響。超聲時(shí)間由3 min延長(zhǎng)到15 min時(shí)破碎率從3%上升到76%，延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間，細(xì)胞膜上會(huì)產(chǎn)生更多的孔洞，細(xì)胞更容易破碎，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞破碎率增加（圖1）。當(dāng)超聲處理時(shí)間超過15 min后，破壁率維持在75%左右，并沒有明顯提高，綜合能耗和經(jīng)濟(jì)效率的角度考慮，采用超聲時(shí)間15 min進(jìn)行超聲處理。

2.1.2 超聲波功率對(duì)細(xì)胞破碎率的影響。

固定料液比、超聲時(shí)間等條件，研究不同超聲波功率對(duì)細(xì)胞破碎率的影響。超聲波功率由300 W升到450 W時(shí)細(xì)胞破碎率由50%增加到73%（圖2）。在劉圣臣等[15]的研究中也呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)。其可能原因是由于超聲波導(dǎo)致細(xì)胞膜表面及周圍的空化氣泡破裂，隨著功率的增大，會(huì)產(chǎn)生大量的裂縫及孔洞，進(jìn)而使細(xì)胞壁破碎率增大[14]。但超過400 W繼續(xù)增大功率，藻細(xì)胞破壁率增加并不明顯，從經(jīng)濟(jì)和效率方面綜合考慮，采用450 W為最佳功率。

2.1.3 料液比對(duì)細(xì)胞破碎率的影響。

固定超聲波功率、超聲時(shí)間等條件，研究不同料液比對(duì)細(xì)胞破碎率的影響。該試驗(yàn)設(shè)計(jì)1∶50，1∶100，1∶200，…，1∶1 000共7個(gè)梯度，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)料液比從1∶100減小到1∶1 000時(shí)，細(xì)胞破碎率先升高后下降;當(dāng)料液比為1∶200時(shí)，細(xì)胞破碎率最高，達(dá)76%;料液比高于1∶200時(shí)液體中藻細(xì)胞濃度過高，細(xì)胞聚集成團(tuán)影響超聲破壁效果，破碎率僅有50%左右。隨著水量的增加，當(dāng)料液比低于1∶200之后藻細(xì)胞濃度降低，導(dǎo)致細(xì)胞破碎率低，因此，1∶200為超聲破碎時(shí)最適合的料液比。

2.2 響應(yīng)面法對(duì)超聲破碎方法進(jìn)行優(yōu)化

根據(jù)表2 的結(jié)果，用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行方差分析。從方差分析結(jié)果可知，試驗(yàn)所選模型極顯著（P<0.01）;一次項(xiàng)中超聲時(shí)間（A）和超聲波功率（B）對(duì)細(xì)胞破碎率的影響達(dá)極顯著（P<0.000 1），料液比（C）對(duì)細(xì)胞破碎率的影響為顯著（P<0.05）;二次項(xiàng)中超聲時(shí)間（A）、超聲波功率（B）、料液比（C） 對(duì)細(xì)胞破碎率的影響均為極顯著（P<0.01）;交互項(xiàng)中AB、AC 影響為顯著（P<0.05），而BC 影響不顯著，可以看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，影響程度從大到小依次為超聲時(shí)間（A）、超聲波功率（B）、料液比（C）。

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得三元二次回歸方程：

Y=80.00+3.25A+1.13B-0.38C+0.25AB+0.25AC-2.75A2-1.00B2 -10.50C2

用Design-Expert 8.0.6 軟件分析模型的可信度，模型的決定系數(shù)R2=0.999 6，R2adj=0.999 1，其中R2越接近1，表明模型預(yù)測(cè)的響應(yīng)值越準(zhǔn)確，可用于試驗(yàn)分析和預(yù)測(cè)。模型變異系數(shù)C.V.% = 0.26 < 10，變異系數(shù)反映試驗(yàn)的可重復(fù)性，其值越小表明試驗(yàn)越精確。模型信噪比Adeq Precision=19.360>4，表明模型的相應(yīng)信號(hào)足夠強(qiáng)，模型可信并可用于擬合試驗(yàn)結(jié)果。綜上分析，該模型可用于分析預(yù)測(cè)超聲波破壁技術(shù)工藝。

根據(jù)回歸分析結(jié)果做響應(yīng)曲面圖，分析超聲時(shí)間、超聲波功率、料液比三者之間交互作用對(duì)細(xì)胞破碎率的影響，其響應(yīng)曲面如圖4～6所示。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出，小球藻破碎最佳提取條件為料液比1∶200、超聲波功率為450 W、超聲時(shí)間15 min，該條件下細(xì)胞破碎率最高，為80%。按最優(yōu)組合方案中的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的藻細(xì)胞破碎率為（79.51±0.19）% （n=3），和預(yù)測(cè)值吻合較好，相對(duì)誤差約為0.61%，表明該回歸模型與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果吻合良好，回歸方程能真實(shí)地反映超聲時(shí)間、超聲波功率、料液比對(duì)藻細(xì)胞破碎率的影響，模型工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)研究了超聲波破碎藻細(xì)胞的最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波破壁工藝，得到如下結(jié)論。

（1）建立了一個(gè)以小球藻破碎率為目標(biāo)值，料液比、超聲波功率、超聲時(shí)間為因子的數(shù)學(xué)模型：Y=80.00+3.25A+1.13B-0.38C+0.25AB+0.25AC-2.75A2-1.00B2-10.50C2，采用此模型在該試驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)小球藻的破碎率。

（2）通過試驗(yàn)結(jié)果的方差分析可知，在該試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)小球藻破碎率的影響順序依次為超聲時(shí)間、超聲波功率、料液比。

（3）小球藻超聲波破碎率的工藝參數(shù)為料液比1∶200、超聲波功率450 W、超聲時(shí)間15 min，在此優(yōu)化工藝條件下，實(shí)際測(cè)得的小球藻破碎率為79.51%。

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