黃酮類化合物對(duì)水華魚腥藻的抑制作用研究

姚華 張幫嬋 齊睿晨

摘? 要：分別選取木犀草素和芹菜素2種黃酮類化感物質(zhì)對(duì)水華魚腥藻進(jìn)行抑制試驗(yàn)，通過測(cè)定藻細(xì)胞數(shù)、抑制率、葉綠素a、MDA、SOD等指標(biāo)研究其抑制效果。結(jié)果表明，木犀草素和芹菜素對(duì)水華魚腥藻均具有明顯的抑制作用，隨著濃度的增加，抑藻效果顯著提高，其中，25mg/L的木犀草素、芹菜素對(duì)水華魚腥藻的抑制率分別達(dá)95.83%和98.84%，水華魚腥藻葉綠素a、MDA和SOD均受到了不同程度的影響?；形镔|(zhì)處于低濃度時(shí)，對(duì)MDA和SOD影響不大;隨著濃度升高，MDA含量顯著增加，抗氧化酶系統(tǒng)受到破壞，藻類生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻。

關(guān)鍵詞：木犀草素;芹菜素;水華魚腥藻;抑制作用

中圖分類號(hào) X52文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）12-0029-3

Abstract：Two kinds of flavonoids （luteolin and apigenin） were used to study the allelopathic inhibitory effects on the growth of Anabaena flos-aquae，the inhibition effects were observed by algae cell concentrations，inhibition rate，chlorophyll a，MDA and SOD.The results showed that luteolin and apigenin had significant inhibitory effects on the growth of A. flos-aquae.The inhibition rate of 25mg/L luteolin and 25mg/L apigenin were 95.83% and 98.84%，respectively. Chlorophyll a，MDA and SOD were affected by different degrees.Allelopathic substances had little effect on MDA and SOD when they had low concentrations，with the increase of concentration，MDA content increased significantly，antioxidant enzyme system was destroyed，and algae growth was seriously blocked.

Key words：Luteolin;Apigenin;Anabaena flos-aquae;Inhibition effect

近年來，伴隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，工業(yè)化、城市化進(jìn)程的不斷加快，工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的氮、磷等物質(zhì)進(jìn)入湖泊、河流等自然水體，致使水體中的富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日益嚴(yán)重。富營(yíng)養(yǎng)化會(huì)導(dǎo)致藻類大面積暴發(fā)性繁殖，給社會(huì)發(fā)展和人類健康造成了一定的影響[1-2]。傳統(tǒng)的抑制藻類方法主要有物理、化學(xué)方法，但存在操作難、費(fèi)用高、生態(tài)環(huán)境危害大等弊端[3]。而化感物質(zhì)控制藻類具有選擇性、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具安全性的生物抑藻技術(shù)之一[4]。水生植物在水體中會(huì)釋放次生代謝產(chǎn)物，對(duì)水體中的藍(lán)藻有化感抑制作用。為此，本研究選取2種黃酮類化感物質(zhì)，研究其對(duì)水華魚腥藻的抑制作用，為藍(lán)藻暴發(fā)水體的治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用水華魚腥藻（Anabaena flos-aquae）（編號(hào)FACHB-245），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫;芹菜素和木犀草素，購(gòu)自天津市盛淼科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 水華魚腥藻的擴(kuò)大培養(yǎng) 試驗(yàn)前利用BG11培養(yǎng)基對(duì)水華魚腥藻進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25℃，光照2500lx，光周期12L∶12D，每隔4h搖動(dòng)藻液1次，待藻細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期后，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以二甲基亞砜為助溶劑[5]，配制木犀草素和芹菜素溶液，過0.22tm濾膜除菌，加入到藻液中，使得化感物質(zhì)的最終濃度為1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL4個(gè)濃度梯度。并設(shè)定空白對(duì)照組。試驗(yàn)設(shè)3組平行。初始藻密度約為0.6×106cells/mL。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 藻細(xì)胞密度 藻細(xì)胞密度測(cè)定采用25×16格的血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算抑制率。抑制率公式為：IR（%）=（1-Nt/Mt）×100。式中：IR為抑制率;Nt為處理組第t天藻細(xì)胞數(shù);Mt為對(duì)照組第t天藻細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 葉綠素a含量 分別取各處理組水華魚腥藻藻液5mL，用95%乙醇進(jìn)行提取，測(cè)定水華魚腥藻葉綠素a的質(zhì)量濃度[6]。

1.3.3 丙二醛（MDA）濃度 藻細(xì)胞丙二醛（MDA）濃度的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[7]。

1.3.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 利用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理間的差異顯著性檢驗(yàn)，采用Excel進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 化感物質(zhì)對(duì)水華魚腥藻生長(zhǎng)的影響 從圖1和圖2可以看出，不同濃度的木犀草素、芹菜素對(duì)水華魚腥藻均表現(xiàn)出抑制作用，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，25mg/L木犀草素和芹菜素均表現(xiàn)出顯著的抑制效果（P<0.01），培養(yǎng)到11d時(shí)木犀草素對(duì)水華魚腥藻的抑制率分別為37.67%、51.17%、86.21%、95.83%，芹菜素的抑制率分別為38.64%、58.94%、90.31%、98.84%。

2.2 化感物質(zhì)對(duì)水華魚腥藻葉綠素a含量的影響 葉綠素a含量的變化可以反映出水華魚腥藻的生長(zhǎng)情況。從圖3、圖4可以看出，不同濃度木犀草素、芹菜素處理下葉綠素a的含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。對(duì)照組中葉綠素a含量始終保持較高水平，處理組中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素a含量下降明顯。黃酮類化感物質(zhì)能進(jìn)入藻細(xì)胞，可以破壞藻類的光合作用，引起葉綠素a分解，以此抑制藻類的生長(zhǎng)[7]。

2.3 化感物質(zhì)對(duì)水華魚腥藻MDA的影響 丙二醛（MDA）是膜脂質(zhì)過氧化過程產(chǎn)生的主要產(chǎn)物之一，其含量高低可以反映脂質(zhì)過氧化的程度。從圖5、圖6可以看出，低濃度木犀草素和芹菜素處理組中，MDA含量比對(duì)照組有微弱的下降，高濃度脅迫下，MDA含量大大增加。在25mg/L處理9d后，水華魚腥藻中的MDA含量分別顯著高出對(duì)照組（P<0.01），表明活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡被打破，脂質(zhì)過氧化程度劇烈。

2.4 化感物質(zhì)對(duì)水華魚腥藻SOD的影響 SOD是一種在清除活性氧反應(yīng)過程中發(fā)揮作用的抗氧化酶，正常情況下SOD活力穩(wěn)定，生物體產(chǎn)生和消除·O-2的能力處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)生物體處于逆境環(huán)境時(shí)，平衡就會(huì)被打破[8]。如圖7、圖8所示，藻液中加入化感物質(zhì)后，各處理組中SOD處于上升趨勢(shì)，化感物質(zhì)濃度越大，SOD上升得越快，當(dāng)化感物質(zhì)為25mg/L時(shí)，藻細(xì)胞中SOD急劇上升后下降，而空白對(duì)照組中SOD一直處于較低水平。這種情況可能是高濃度化感物質(zhì)脅迫下，水華魚腥藻的抗氧化系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)起作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，使得SOD含量下降。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，木犀草素和芹菜素對(duì)水華魚腥藻均具有顯著抑制作用，且抑制效果差異不大，對(duì)葉綠素a、MDA、SOD的含量具有一定程度的影響。2種化感物質(zhì)可以通過破壞藻的光合系統(tǒng)、細(xì)胞膜、抗氧化酶來抑制其生長(zhǎng)，當(dāng)藻細(xì)胞處于逆境中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被打破，產(chǎn)生過剩的自由基，使得SOD活性變高，加劇膜脂過氧化作用，又會(huì)使得MDA濃度升高，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷，以此抑制藻類的生長(zhǎng)。本研究將有助于為藍(lán)藻的治理以及化感抑藻劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]朱嘉成，周利，朱佳，等.水生觀賞植物紅掌對(duì)銅綠微囊藻的化感作用[J].環(huán)境科學(xué)研究，2015，28（10）：1638-1644.

[2]SUN X X，Choi J K，Kim E K.A preliminary study on the mechanism of harmful algal bloom mitigation by use of sophorolipid treatment[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2004，304：35-49.

[3]梁印，梁止水.藍(lán)藻治理方法概述[J].污染防治技術(shù)，2011，24（3）：67-68，78.

[4]沈冰潔，陳明利，吳曉芙.利用植物化感作用抑藻的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2013，12.

[5]黃皓旻，天然黃酮類化合物的抑藻活性_結(jié)構(gòu)關(guān)系_作用機(jī)制及抑藻劑開發(fā)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2016.

[6]王學(xué)奎.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2006.

[7]李合生，孫群，趙世杰，等.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000：184-185，260-261.

[8]吳穎川，鄒琳，汪瑾，等.EGCG對(duì)銅綠微囊藻的抑制效應(yīng)及機(jī)制研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，39（1）：78-83.

[9]李輝，吳婷，楊維東，等.十種黃酮類化合物對(duì)兩種赤潮藻的抑制作用[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版），2012，2：15.

（責(zé)編：張宏民）