Box-Behnken結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化制備氟尿嘧啶長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體

吳義來(lái)，汪魏平，徐文科

氟尿嘧啶（Fluorouracil，F(xiàn)U）作為經(jīng)典的抗腫瘤藥，其抗瘤譜廣，對(duì)消化道腫瘤、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、絨毛膜上皮癌和皮膚癌等均有一定療效.臨床上，F(xiàn)U單獨(dú)使用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用于乳腺癌和胃腸道腫瘤手術(shù)后的輔助治療［1］.但是，F(xiàn)U脂溶性小，口服吸收不規(guī)則，生物利用度低，故一般采用靜脈給藥.持續(xù)輸液可較長(zhǎng)時(shí)間在機(jī)體中維持有效血藥濃度，臨床效果優(yōu)于靜脈推注，但較長(zhǎng)時(shí)間的輸液降低了患者的依從性和順應(yīng)性.另外，F(xiàn)U嚴(yán)重的骨髓抑制和消化道毒性等強(qiáng)烈的毒副作用發(fā)生率較高，這些缺點(diǎn)都極大限制了其臨床應(yīng)用［2-3］.

脂質(zhì)體是一種由磷脂或其他輔助成分分散于水相中有序排列形成的單層或多層囊泡，其磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)類似生物膜，故相容性較好［4］.本研究擬采用經(jīng)典的熱敏長(zhǎng)循環(huán)處方：二棕櫚酰基卵磷脂（Dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、單鏈溶血磷脂（Mono-stearoyl phosphatidylcholine，MSPC）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙 二 醇 2000（Distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，DSPE-PEG2000）制備氟尿嘧啶長(zhǎng)循環(huán)熱敏脂質(zhì)體（Fluorouracil loaded Long-circulating thermo-sensitive liposomes，F(xiàn)U-LCTSLs），利 用Box-Behnken結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化各成分比例，制備包封率較高、穩(wěn)定性較好的FU-LCTSLs，為后續(xù)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ).

1 材料

1.1 藥品與試劑

FU（美國(guó)Sigma公司，純度＞99%）；DPPC（日本NFC公司，純度99.5%）；MSPC（日本NFC公司，純度97.2%）；DSPE-PEG2000（日本NFC公司，純度99.86%）；NaCl（天津德恩化工試劑有限公司）；KCl（天津博迪化工股份有限公司）；Na2HPO4·12H2O（天津天力化工試劑有限公司）；KH2PO4（天津化工試劑三廠）；濃鹽酸（武漢中天化工有限責(zé)任公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克）；無(wú)水乙醇（分析純，天津德恩試劑有限公司）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）.

1.2 儀器與耗材

高效液相色譜系統(tǒng)（含Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 1525二元泵、Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器及BreezeTM2操作系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司）；微型脂質(zhì)體擠出器（Avestin，加拿大）；高速離心機(jī)（ThermoFisher，美國(guó)）；分析天平（FA1004型電子天平，上海天平儀器廠）；精密天平（AUW220D型電子天平，日本島津公司）；超聲清洗儀（SK-8200HP型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；真空泵（SHB-Ⅲ循環(huán)水式泵，鄭州長(zhǎng)城有限公司）；純水制備儀（優(yōu)普超純水機(jī)，成都超純科技有限公司）；精密pH計(jì)（pHS-3B型，上海精科雷磁科學(xué)儀器有限公司）；普通冰箱（BCD-216T XZ型冰箱，青島海爾有限公司）.

2 方法與結(jié)果

2.1 FU-LCTSLs制備

按處方量分別稱取DPPC、MSPC及DSPEPEG2000（DPPC∶ MSPC∶ DSPE- PEG2000=86∶10∶4，摩爾比），溶于氯仿/乙醚混合液（1∶2，V/V），置于500 mL茄形瓶中.將FU溶于pH=4.0的檸檬酸緩沖溶液中，緩慢加入茄形瓶中，渦旋3 min混合有機(jī)相和水相，水浴超聲至形成均一穩(wěn)定的W/O型乳狀液（靜置30 s不分層）.55℃減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，使乳液在瓶壁上形成凝膠，繼續(xù)旋蒸至凝膠脫落，得到均勻的脂質(zhì)體混懸液.用1 mol/L磷酸氫二鈉溶液將pH調(diào)至7.4，以pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液調(diào)至適當(dāng)濃度后，55℃水浴保溫15 min.所得脂質(zhì)體混懸液25℃水浴超聲10 min后擠壓通過(guò)100 nm聚碳酸酯膜，得到粒徑約100 nm的脂質(zhì)體.

2.2 FU含量測(cè)定方法學(xué)建立

（1）色譜條件.色譜柱：Thermo Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（35∶65，V/V）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL.

（2）專屬性試驗(yàn).取0.4 mL空白脂質(zhì)體、FU脂質(zhì)體分別以0.4 mL甲醇破乳后進(jìn)樣10 μL，按2.2（1）所述色譜條件分析，記錄色譜圖.FU保留時(shí)間在4.5 min左右，峰型良好，空白脂質(zhì)體以及破乳劑甲醇對(duì)FU的含量測(cè)定無(wú)干擾.

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立.稱取FU對(duì)照品12.03mg，以流動(dòng)相溶解，定容至25 mL，所得標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為481.20 μg/mL，作為母液，4℃避光保存?zhèn)溆?精密吸取母液，稀釋成濃度為481.20 μg/mL、240.60 μg/mL、60.15 μg/mL、30.08 μg/mL、15.04 μg/mL、7.52 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各進(jìn)樣10 μL，按2.2（1）所述色譜條件分析，記錄色譜圖和峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c為橫坐標(biāo)，F(xiàn)U峰面積響應(yīng)值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程A=32740c+14 670，相關(guān)系數(shù)r=0.9998.結(jié)果顯示，在7.52～481.20μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好.

（4）精密度試驗(yàn).日內(nèi)精密度：取制備好的FU脂質(zhì)體，按樣品處理方法制備6批樣品，連續(xù)進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD%；日間精密度：取制備好的同一批FU脂質(zhì)體，按樣品處理方法處理后，連續(xù)6天進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD%.日內(nèi)精密度和日間精密度試驗(yàn)RSD%分別為1.19%、1.10%，說(shuō)明該檢測(cè)方法精密度良好.

（5）回收率試驗(yàn).取9支EP管，各加入0.4 mL空白脂質(zhì)體，分別加低濃度（15.04 μg/mL）、中濃度（240.60 μg/mL）、高濃度（481.20 μg/mL）FU對(duì)照品溶液各0.8 mL，每濃度各加三支EP管，加0.4 mL甲醇，渦旋破膜，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，低、中、高濃度樣品平均加樣回收率分別為97.52%、99.54%和99.13%，符合方法學(xué)要求.

（6）包封率測(cè)定方法.本實(shí)驗(yàn)采用超濾離心法分離游離藥物.精密吸取0.4 mL已制備的載藥脂質(zhì)體于超濾管內(nèi)，將超濾管套入剪去管帽的EP管中，8 000 rpm離心30 min，向超濾管中加0.4 mL的PBS，繼續(xù)離心30 min，收集EP管中濾液，進(jìn)樣分析，測(cè)定游離藥物含量；另取0.4 mL載藥脂質(zhì)體0.4 mL甲醇破乳后，進(jìn)樣分析，測(cè)定藥物總含量，按下式計(jì)算包封率.

包封率（EE）%=脂質(zhì)體包封的藥物量/（脂質(zhì)體包封藥物量+游離藥物量）×100%.

2.3 處方優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)利用Design Expert軟件實(shí)現(xiàn)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法結(jié)合響應(yīng)面法（BBD-RSM），以脂質(zhì)體的包封率為響應(yīng)值Y（%），選取對(duì)脂質(zhì)體包封率影響較為顯著的3個(gè)因素，分別記作X1（磷脂與FU質(zhì)量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機(jī)相與水相體積比），在-1、0、+1三個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化研究，建立多元二次回歸方程數(shù)學(xué)模型［5-6］.各因素水平見(jiàn)表1，建立的Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示.

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平

2.3.1 二次回歸方程的建立

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸分析，得到X1、X2、X3與Y的二次多項(xiàng)回歸方程

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

表3 包封率回歸模型方差分析

由方差分析結(jié)果可知，模型F值=42.20，P＜0.000 1，表明模型極顯著；P＜0.05的模型項(xiàng)顯著，所以本試驗(yàn)中X1、X2、X3、X1X3、、對(duì)Y的影響極顯著，其他項(xiàng)對(duì)Y的影響不顯著.故上述多元二次回歸模型可優(yōu)化為

模型的概率P＜0.000 1，表明模型極顯著；同時(shí)，方程的失擬項(xiàng)F值為2.75，概率P＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好，可以用該模型準(zhǔn)確模擬X1（磷脂與FU質(zhì)量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機(jī)相與水相體積比）對(duì)Y（包封率%）的影響［7］.

2.3.2 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測(cè)

利用Design-Expert軟件分別固定X1（磷脂與FU質(zhì)量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機(jī)相與水相體積比）三個(gè)影響因素其中之一，分析其他兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值Y（包封率%）的影響，繪制得到不同影響因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲線圖和二維等高線，見(jiàn)圖1.

根據(jù)BBD-RSM試驗(yàn)結(jié)果，得到優(yōu)化條件為：脂質(zhì)體膜材與氟尿嘧啶的質(zhì)量比為9.2∶1，水化液中氟尿嘧啶的濃度為10 mg·mL-1，有機(jī)相與水相的體積比為7∶1.

圖1 各因素對(duì)包封率Y的3D響應(yīng)面圖和等高線圖

表4 驗(yàn)證及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述優(yōu)化條件，制備3批最優(yōu)處方樣品并分別測(cè)定包封率，以檢驗(yàn)BBD-RSM試驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性.按BBD-RSM試驗(yàn)所得最優(yōu)處方包封率的理論值為41.26%，而3批樣品實(shí)測(cè)包封率的平均值為40.85%，RSD為1.93%，說(shuō)明此模型可靠，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確.

由以上結(jié)果可以看出，該處方工藝重現(xiàn)性良好，制備的脂質(zhì)體粒徑符合要求，包封率穩(wěn)定，適用于制備FU-LCTSLs.

2.4 理化性質(zhì)研究

對(duì)經(jīng)優(yōu)化后的FU-LCTSLs理化性質(zhì)進(jìn)行考察，主要包括粒徑分布、Zeta電位、pH值以及熱敏特性考察.

2.4.1 粒徑分布和Zeta電位

取制備好的FU-LCTSLs于EP管中，PBS稀釋10倍，混合均勻后加入比色皿，檢測(cè)FU-LCTSLs樣品的粒徑和Zeta電位.每個(gè)樣品平行測(cè)定3次.

同一份樣品平行測(cè)定所得粒徑結(jié)果精密度良好，平均粒徑113.7±8.7 nm，PDI=0.538±0.072.粒徑結(jié)果表明，F(xiàn)U-LCTSLs粒徑大部分分布在110 nm左右，且粒徑較規(guī)整均一.平均Zeta電位為-15.34±4.26 mV.

2.4.2 pH值

磷脂通常在中性條件下較穩(wěn)定，為了保證脂質(zhì)體在儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性，減少磷脂的水解，脂質(zhì)體制備過(guò)程最后將其pH調(diào)節(jié)到7.4，并且以pH=7.4的PBS緩沖液稀釋，維持較穩(wěn)定的中性pH環(huán)境.制備好的FU-LCTSLs溶液以pH計(jì)測(cè)得的pH值為7.35±0.04（n=3）.符合脂質(zhì)體保存的pH條件要求.

2.4.3 熱敏性評(píng)價(jià)

熱敏性好壞是評(píng)價(jià)熱敏脂質(zhì)體制備成功與否的關(guān)鍵因素之一.成功的熱敏脂質(zhì)體在正常體溫單位內(nèi)保持不釋藥，當(dāng)?shù)竭_(dá)正接收熱療的腫瘤靶部位，熱療溫度使熱敏脂質(zhì)體膜從緊密有序的膠晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲蓙y松散的液晶態(tài)，脂質(zhì)體內(nèi)部包載的抗腫瘤藥物大量釋放，從而迅速達(dá)到治療濃度.

本研究中，我們以水浴法結(jié)合超濾離心法分別考察FU-LCTSLs在正常體溫37℃至熱療溫度42℃間不同溫度環(huán)境下的釋藥行為，用以評(píng)價(jià)制備得到的FU-LCTSLs熱敏性.

（1）溫度依賴的熱敏釋放行為.取6支玻璃試管，分別加入等量適量的14102001批次脂質(zhì)體，6支試管做標(biāo)記后分別放入37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃水浴鍋中，加熱8 min后立即取出試管，冰浴冷卻，超濾離心法測(cè)定游離藥物濃度，計(jì)算釋藥率.結(jié)果如圖2.

圖2 不同溫度下FU-LCTSLs釋藥率直方圖

由圖2可知，F(xiàn)U-LCTSLs對(duì)溫度變化較為敏感，當(dāng)水浴溫度低于40℃時(shí)，8 min釋藥率不超過(guò)20%，而當(dāng)溫度達(dá)40℃時(shí)釋藥開(kāi)始加快，42℃時(shí)8 min釋藥率達(dá)96.49%，包封FU近乎完全釋放.FU-LCTSLs表現(xiàn)出良好的溫度敏感性.

（2）時(shí)間依賴的熱敏釋放行為.取2支玻璃試管，分別加入等量適量的14102001批次脂質(zhì)體，pH=7.4的PBS稀釋4倍，試管做好標(biāo)記后分別放入37℃、42℃水浴鍋中溫育，分別在1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、8 min、15 min、30 min取0.4 mL脂質(zhì)體懸浮液置EP管中（同時(shí)用0.4 mL等溫的PBS補(bǔ)液），冰浴冷卻，超濾離心法測(cè)定游離藥物濃度，計(jì)算釋藥率，繪制時(shí)間-釋藥率曲線，結(jié)果如圖3.

圖3 FU-LCTSLs在37℃和42℃水浴條件中的釋藥曲線

由圖3可知，37℃水浴30 min FU釋藥率僅4.32%，而在42℃水浴條件下，8 min時(shí)藥物幾乎全部釋放.采用Origin對(duì)FU-LCTSLs在42℃下的釋放曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 42℃FU-LCTSLs釋放曲線動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果

體外釋放模型相關(guān)性從高到低依次為：一級(jí)＞Higuchi＞零級(jí)，說(shuō)明FU-LCTSLs在42 ℃條件下的釋放最優(yōu)擬合為一級(jí)釋放模型.

2.5 穩(wěn)定性考察

2.5.1 過(guò)濾穩(wěn)定性

動(dòng)物試驗(yàn)所用脂質(zhì)體必須無(wú)菌無(wú)熱原，通常脂質(zhì)體產(chǎn)品要求在無(wú)菌環(huán)境下制備，結(jié)束后需要進(jìn)行過(guò)濾除菌.過(guò)濾除菌法又稱微孔過(guò)濾法，微孔濾膜的孔徑為0.22 μm，可有效濾除制劑中大小為0.3 μm以上的大部分細(xì)菌，適用于工業(yè)生產(chǎn)中的脂質(zhì)體除菌.過(guò)濾穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)過(guò)濾前后脂質(zhì)體的漏藥率進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而評(píng)估過(guò)濾除菌的可行性.

取兩支一次性注射器針筒，在超凈工作臺(tái)中將其套上已滅菌的0.22 μm濾頭，分別取14102001批FU-LCTSLs溶液和5倍稀釋液于注射器中，輕推注射器過(guò)濾，將濾液注入已滅菌的西林瓶中，取過(guò)濾后的脂質(zhì)體溶液測(cè)定漏藥率，結(jié)果如表6.

其中，W前為脂質(zhì)體過(guò)濾前包封的藥物濃度；W后為脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)濾除菌后包封的藥物濃度.

表6 過(guò)濾穩(wěn)定性結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)U-LCTSLs溶液原液過(guò)濾后包封率有所下降，而稀釋液包封率基本不變.可能是因?yàn)樵褐兄|(zhì)體濃度較高，通過(guò)濾孔時(shí)發(fā)生相互擠壓的機(jī)率和頻率較大，脂質(zhì)體本身產(chǎn)生一定程度的破碎，繼而融合，使得藥物略有滲漏.稀釋液中脂質(zhì)體濃度相對(duì)較低，通過(guò)濾孔時(shí)發(fā)生擠壓的頻率次數(shù)較少，所以包封率基本沒(méi)有發(fā)生變化，過(guò)濾穩(wěn)定性良好.

2.5.2 稀釋穩(wěn)定性

取FU-LCTSLs加入至兩個(gè)西林瓶中，分別加入5%葡萄糖溶液和注射用水稀釋20倍，室溫放置6 h，測(cè)定漏藥率，平行測(cè)定三次，結(jié)果如表7.

表7 稀釋穩(wěn)定性結(jié)果（%）

由試驗(yàn)結(jié)果可知，以5%葡萄糖溶液和注射用水稀釋FU-LCTSLs，包封率均未發(fā)生顯著變化，說(shuō)明FU-LCTSLs的稀釋穩(wěn)定性較好.

2.5.3 貯藏穩(wěn)定性

取FU-LCTSLs于西林瓶中，分別置于4℃冰箱和25℃室溫避光保存，于第5天和第10天取出，檢測(cè)脂質(zhì)體漏藥率，結(jié)果見(jiàn)表8.

表8 不同溫度穩(wěn)定性結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)U-LCTSLs室溫避光放置漏藥率較高，而4℃避光冷藏則相對(duì)穩(wěn)定，因而將FU-LCTSLs貯藏方式確定為4℃避光冷藏.

2.5.4 放樣穩(wěn)定性

取FU-LCTSLs于西林瓶中，放入4℃冰箱內(nèi)，于0月、1月、2月、3月和6月取樣檢測(cè)脂質(zhì)體漏藥率，結(jié)果見(jiàn)表9.

表9 FU-LCTSLs 4℃放樣6個(gè)月漏藥率結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)U-LCTSLs在4℃貯藏條件下保存6個(gè)月漏藥率仍保持在較低水平，理化性質(zhì)基本保持穩(wěn)定.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，確定FU-LCTSLs采用文獻(xiàn)中經(jīng)典熱敏長(zhǎng)循環(huán)處方：DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000=86∶10∶4（摩爾比）.DPPC相變溫度41℃，在人體能夠耐受的局部加熱溫度范圍內(nèi)是最常用的熱敏脂質(zhì)體膜材.處方中加入少量水溶性單鏈磷脂MSPC，在溫度達(dá)DPPC相變溫度時(shí)，MSPC可尾部相互聚集，頭部在脂質(zhì)體表面形成釋藥小孔，加速藥物從內(nèi)部釋放到腫瘤熱療部位.另外，DSPE-PEG2000摻入脂質(zhì)體后，親水PEG2000鏈在脂質(zhì)體表面形成致密的構(gòu)象云，避免脂質(zhì)體迅速被MPS識(shí)別并吞噬，從而顯著延長(zhǎng)脂質(zhì)體在體內(nèi)循環(huán)中的滯留時(shí)間，利用EPR效應(yīng)，這些長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體會(huì)相對(duì)多地靶向到腫瘤部位.

制備脂質(zhì)體時(shí)，主動(dòng)載藥法制備的脂質(zhì)體包封率較大，性質(zhì)較穩(wěn)定，不易發(fā)生藥物的泄漏，本文將主動(dòng)載藥法與被動(dòng)載藥法相結(jié)合，即pH梯度法結(jié)合逆相蒸發(fā)法，制備大單室脂質(zhì)體，有利于親水性藥物FU的包封，而pH梯度法極大地提高了包封率.經(jīng)優(yōu)化后的FU-LCTSLs外觀半透明而帶藍(lán)色乳光，平均粒徑113.7±8.7 nm，PDI=0.538±0.072，表明FU-LCTSLs粒徑大部分分布在110 nm左右，且粒徑較規(guī)整均一；平均Zeta電位-15.34±4.26 mV，在膠態(tài)體系中能較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，不聚集.脂質(zhì)體溶液的pH值為7.35±0.04（n=3），符合脂質(zhì)體儲(chǔ)存的pH要求.FULCTSLs對(duì)溫度變化較為敏感，當(dāng)水浴溫度低于40℃時(shí)，8 min釋藥率不超過(guò)20%，而當(dāng)溫度達(dá)40℃時(shí)釋藥開(kāi)始加快，42℃時(shí)8 min釋藥率達(dá)96.49%，包封FU近乎完全釋放.FU-LCTSLs表現(xiàn)出良好的溫度敏感性提示FU-LCTSLs在正常血液循環(huán)內(nèi)會(huì)保持不釋藥，當(dāng)利用EPR富集到正接收熱療的腫瘤靶部位時(shí)，脂質(zhì)體內(nèi)部包載的抗腫瘤藥物會(huì)大量釋放，迅速達(dá)到治療濃度，從而實(shí)現(xiàn)增效減毒的作用.

Box-Behnken設(shè)計(jì)具有預(yù)測(cè)性好、結(jié)果直觀、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，能以最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)更快更高效地優(yōu)化工藝參數(shù)，目前在藥物處方篩選方面已得到非常廣泛的應(yīng)用［8-9］.本試驗(yàn)運(yùn)用Box-Behnken結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)選脂質(zhì)體制備處方，極大地減少了工作量，成功地構(gòu)建X1（磷脂與FU質(zhì)量比）、X2（水化液FU濃度），X3（有機(jī)相與水相體積比）對(duì)包封率影響的模型，并直觀地預(yù)測(cè)了最優(yōu)處方.按所得優(yōu)化條件制備3批樣品分別測(cè)定其包封率，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，模型預(yù)測(cè)最優(yōu)處方脂質(zhì)體包封率理論值為41.26%，實(shí)測(cè)包封率的平均值為40.85%，偏差為0.41%，說(shuō)明此模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠.處方工藝重現(xiàn)性良好，制備的脂質(zhì)體粒徑符合要求，包封率穩(wěn)定，適合用于制備FU-LCTSLs.

穩(wěn)定性試驗(yàn)包括對(duì)過(guò)濾穩(wěn)定性、稀釋穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性和長(zhǎng)期放樣穩(wěn)定性等的考察，結(jié)果顯示，F(xiàn)U-LCTSLs可成功通過(guò)過(guò)濾滅菌而不發(fā)生較多FU泄漏，與5%葡萄糖注射液和滅菌注射用水混合稀釋至20倍滲漏率在可接受范圍.貯藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)提示，F(xiàn)U-LCTSLs的短期貯藏應(yīng)保持在4℃冷藏室中.長(zhǎng)期放樣實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)U-LCTSLs混懸液滲漏率隨時(shí)間延長(zhǎng)而加快，如想長(zhǎng)期放置仍需考察凍干后保存的滲漏率變化.