水酶法提取紫蘇籽油脂工藝

袁德成 王 菲 崔新爽 李曉雪 楊逢建

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

紫蘇(Perillafrutescens)為一年生唇形科(Labiatae)草本植物，又名荏子、赤蘇、紅蘇等是傳統(tǒng)的藥用、油用以及香料植物[1]。紫蘇渾身是寶，其籽和梗中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，紫蘇葉也成為人們餐桌上的美味。近年來，隨著人們對(duì)紫蘇的認(rèn)知加深，對(duì)紫蘇中所含有的活性物質(zhì)以及營(yíng)養(yǎng)成分的研究成為一大熱點(diǎn)。目前，對(duì)紫蘇的研究集中在其油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上，例如紫蘇油的保健品，以及紫蘇油膠囊的開發(fā)。紫蘇籽油是一種具有高營(yíng)養(yǎng)的保健食用油。其不飽和脂肪酸以油酸、亞油酸、α-亞麻酸為主，約占脂肪酸總量的90%，其中，α-亞麻酸是紫蘇籽油的最主要成分，含量可達(dá)58%～71%[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外油脂的提取方法主要集中于壓榨法、溶劑浸出法[3]及CO2超臨界萃取法[4～5]。水酶法[6]具有耗能少，時(shí)間短以及毛油品質(zhì)高等特點(diǎn)，并且提取油脂工藝操作簡(jiǎn)便，處理?xiàng)l件溫和，不會(huì)破壞油脂營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能同時(shí)得到高質(zhì)量的毛油和蛋白質(zhì)，有利于提高油料作物資源綜合利用率。本試驗(yàn)采用水酶法從紫蘇籽中提取油脂，水酶法在提取油脂的同時(shí)能高效的回收油料中其他價(jià)值組分，被油脂科學(xué)界稱為“一種油料資源的全利用技術(shù)”。與傳統(tǒng)工藝相比，其在能耗、環(huán)境和安全衛(wèi)生等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。通過單因素試驗(yàn)的篩選，確定條件范圍，借助于響應(yīng)面分析法求得回歸方程，可以準(zhǔn)確的確定試驗(yàn)因素之間的交互作用在工藝過程中對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值的影響，且試驗(yàn)具有周期短、精度高等優(yōu)點(diǎn)。通過響應(yīng)面[7]優(yōu)化分析得到最佳工藝，為生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽購(gòu)買于黑龍江省伊春市林業(yè)局，種粒飽滿干燥無霉變；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶購(gòu)買于上海源葉生物科技有限公司；正己烷、甲醇均為分析純，購(gòu)買于南京百倫斯貿(mào)易實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-800A中藥粉碎機(jī)；TB-215D型電子天；TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；安捷倫GC7890氣相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)的測(cè)定

過氧化值測(cè)定：采用GB/T 5538-2005《動(dòng)植物油脂過氧化值測(cè)定》[8]；酸值測(cè)定：采用GB/T 5530-2005《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定》[9]；皂化值測(cè)定：采用GB/T 5534-2008《動(dòng)植物油脂皂化值的測(cè)定》[10]；碘值的測(cè)定：采用GB/T 5532-2008《動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定》[11]；水分及揮發(fā)物的測(cè)定：采用BG/T 5528-2008《動(dòng)植物油脂水分及揮發(fā)物含量測(cè)定》[12]；折光指數(shù)的測(cè)定：采用GB/T 5527-2010《動(dòng)植物油脂折光指數(shù)的測(cè)定》[13]；相對(duì)密度的測(cè)定：采用GB/T 5518-2008《油糧檢測(cè)糧食、油料相對(duì)密度的測(cè)定》[14]；不飽和脂肪酸檢測(cè)：氣相色譜儀。

1.3.2 工藝流程

紫蘇種子用粉碎機(jī)破碎10 s，準(zhǔn)確稱取10 g的紫蘇籽粉，加入一定比例水?dāng)嚢杈鶆蚝?，? mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH，450 r·min-1適當(dāng)溫度水浴攪拌一定時(shí)間后，加熱90℃保持10 min，然后11 000 r·min-1高速離心15 min，分離得到清油Ⅰ、乳狀液、水解液、殘?jiān)瘛Ｈ闋钜翰捎美鋬銎迫榉绞?，得到清油Ⅱ及殘?jiān)?。收集殘?jiān)窦皻堅(jiān)颍粚堅(jiān)?0℃烘干。

油提取率采用下式計(jì)算：

1.4 紫蘇籽油提取單因素試驗(yàn)

對(duì)水酶法提取的酶解溫度、pH、液固比、加酶量、酶解時(shí)間分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察這5個(gè)因素對(duì)紫蘇籽油脂提取率的影響。

1.4.1 酶解溫度的影響

pH9.5，液固比5∶1，加酶量1.5%，酶解時(shí)間5h，酶解溫度分別為40、45、50、55和60℃，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 pH的影響

酶解溫度55℃，液固比5∶1，加酶量1.5%，酶解時(shí)間5 h，pH分別為pH7.5、8、8.5、9、9.5、10和10.5，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 液固比的影響

酶解溫度55℃，pH9.5，加酶量1.5%，酶解時(shí)間5 h，液固比分別為3∶1，5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4 加酶量的影響

酶解溫度55℃，pH9.5，液固比5∶1，酶解時(shí)間5 h，加酶量分別為0、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 酶解時(shí)間的影響

酶解溫度55℃，pH9.5，液固比5∶1，加酶量1.5%，酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、7 h，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 紫蘇籽油提取的中心組合設(shè)計(jì)—響應(yīng)面法優(yōu)化

由單因素試驗(yàn)選出對(duì)紫蘇籽油脂提取最顯著的4個(gè)因素及變化范圍：液固比范圍是4∶1～6∶1，加酶量范圍是1.25%～1.75%，酶解溫度范圍是52.5～57.5℃，酶解時(shí)間范圍是3.75～5.25 h，以油脂提取率為響應(yīng)值進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，中心組合設(shè)計(jì)因素詳見表1，并依據(jù)表2進(jìn)行30次試驗(yàn)。

表1 紫蘇籽油脂提取工藝中心組合設(shè)計(jì)的因素與水平

Table 1 Factors and levels of center combined design ofPerillaseed oil extraction process

編碼水平Coding level因素FactorsX1液固比Solid-liquid ratio(g·mL-1)X2加酶量Enzyme added(%)X3溫度Temperature(℃)X4時(shí)間Time(h)-α31503-141.2552.53.75051.5554.5161.7557.55.25+α72606

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的篩選

水酶法提油的原理是通過酶分解植物油料中富含粗纖維的細(xì)胞壁、脂蛋白、脂多糖，從而使油釋放出來，酶的選擇在水酶法工藝中至關(guān)重要，不同酶對(duì)紫蘇籽油提取的效果存在很大差異。由圖1可知，其中堿性蛋白酶效果最好提取率為30.5%，其次是中性蛋白酶，無酶和果膠酶效果最差。堿性蛋白酶的高提取率一方面可能是由于其性質(zhì)更容易與紫蘇籽蛋白發(fā)生相互作用，另一方面堿性蛋白酶的最適提取條件是在堿性環(huán)境下進(jìn)行的，高pH能增大蛋白的水解度，更有利于油脂的釋放。堿性蛋白酶的最適pH為9.5，遠(yuǎn)離紫蘇籽蛋白等電點(diǎn)，可以很好的酶解蛋白，使油料細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞，以至于油游離出來[15]。油脂在與氫氧化鈉發(fā)生皂化反應(yīng)時(shí)，1 g油脂需消耗0.15 g氫氧化鈉，配制pH溶液所需要的氫氧化鈉是特別微量的，所以不會(huì)發(fā)生油脂的皂化反應(yīng)，且堿性蛋白酶效果顯著，因此選用堿性蛋白酶做為提取工藝的酶制劑。

圖1 酶種類對(duì)紫蘇籽油提取率的影響 1.無酶；2.中性蛋白酶；3.淀粉酶；4.果膠酶；5.胰蛋白酶；6.堿性蛋白酶；7.木瓜蛋白酶Fig.1 Effect of enzymes on Perilla seed oil extraction1.Enzyme free；2.Neutral protease；3.Amylase；4.Pectinase；5.Trypsin；6.Alkaline protease；7.Papain

圖2 酶解pH值對(duì)紫蘇籽油提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis pH on Perilla seed oil extraction

圖3 酶解溫度對(duì)紫蘇籽油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on Perilla seed oil extraction rate

圖4 液固比對(duì)紫蘇籽油提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of Perilla seed oil

2.2 pH值的確定

選用堿性蛋白酶，在液(mL)固(g)比5∶1、加酶量1.5%、酶解時(shí)間5 h、溫度55℃的條件下，考察pH值對(duì)紫蘇籽油提取率的影響。堿性蛋白酶的pH范圍是9.0～10.5，由圖2可以得出，pH在9、9.5、10時(shí)提取率分別為：31.11%、31.62%、30.19%，在這個(gè)范圍內(nèi)pH值對(duì)油提取率基本沒有影響，所以CCD中心組合設(shè)計(jì)pH值因素固定，選用pH值為9.5。

2.3 紫蘇籽油脂工藝提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)選用堿性蛋白酶為水酶法提取紫蘇籽油酶制劑，固定pH值為9.5，考察液(mL)固(g)、加酶量、酶解時(shí)間及溫度的單因素對(duì)紫蘇籽油提取率的影響。

2.3.1 酶解溫度對(duì)紫蘇籽油提取率的影響

在液(mL)固(g)比5∶1、加酶量1.5%、酶解時(shí)間為5 h的條件下酶解溫度在50～55℃范圍時(shí)，提取率上升趨勢(shì)明顯，并且在55℃時(shí)達(dá)到最高30.66%，超過55℃時(shí)呈下降趨勢(shì)，因此選用酶解溫度為55℃(圖3)。

2.3.2 液固比對(duì)紫蘇籽油提取率的影響

在酶解溫度為55℃、加酶量1.5%、酶解時(shí)間為5 h的條件下，液固比在3∶1～5∶1范圍時(shí)，提取率上升趨勢(shì)明顯，隨著液固比增大提取率變化并不明顯，液固比過大，酶解濃度在整個(gè)體系中降低，底物與酶相互接觸的機(jī)會(huì)減少，影響反應(yīng)速度，因此選用液(mL)固(g)比為5∶1(圖4)。

圖5 加酶量對(duì)紫蘇籽油提取率的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on Perilla seed oil extraction rate

2.3.3 加酶量對(duì)紫蘇籽油提取率的影響

在酶解溫度為55℃、液(mL)固(g)比5∶1、酶解時(shí)間為5 h的條件下，隨著加酶量的增加，提油率呈上升趨勢(shì)，為正相關(guān)。加酶量0～0.5%范圍急劇升高，在加酶量達(dá)到1.5%時(shí)開始趨于平緩，酶量的增加提高了整個(gè)體系的反應(yīng)效果，增加到一定量時(shí)底物與酶作用達(dá)到飽和，考慮經(jīng)濟(jì)成本因素，本試驗(yàn)選用加酶量為1.5%(圖5)。

2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)紫蘇籽油提取率的影響

在酶解溫度為55℃、液(mL)固(g)比5∶1、加酶量1.5%的條件下，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，油提取率逐漸增加，在5 h時(shí)達(dá)到最高33.6%，再延長(zhǎng)時(shí)間底物減少，與酶相互作用效果降低，油提率不再隨時(shí)間延長(zhǎng)而提高，同時(shí)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使油脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，降低油脂品質(zhì)[16]。因此本試驗(yàn)選用5 h為酶作用時(shí)間(圖6)。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)紫蘇籽油提取率的影響Fig.6 The effect of enzymolysis time on the extraction rate of Perilla seed oil

2.4 紫蘇籽油提取工藝的中心組合設(shè)計(jì)—響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上建立對(duì)紫蘇籽油水酶法提取工藝的參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，其中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 紫蘇籽油提取工藝中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 2Perillaseed oil extraction technology center combination test design and results

試驗(yàn)號(hào)Test number水平LevelX1X2(%)X3(℃)X4(h)提取率Extraction rate(%)141.7552.53.7529.29241.2557.55.2532.03361.2552.53.7530.50471.5055.04.5032.63551.5055.06.0032.55651.5050.04.5028.38761.7552.55.2530.26831.5055.04.5028.87961.7557.53.7533.691061.2557.55.2532.661151.0055.04.5030.461251.5055.04.5031.551351.5055.04.5030.961441.7557.55.2532.951551.5055.04.5032.001661.7557.55.2535.491741.2552.53.7529.421841.7557.53.7530.911941.2552.55.2529.942051.5055.03.0029.222161.2552.55.2531.462252.0055.04.5031.042351.5055.04.5031.772441.2557.53.7530.392551.5055.04.5031.492651.5055.04.5032.552761.2557.53.7531.232841.7552.55.2531.912961.7552.53.7531.663051.5060.04.5035.18

表3 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

Table 3 Regression model coefficients and significance test results

來源Source平方和ss自由度df均方msF值F-valuePr>FP-value模型Model61.85415.4620.05<0.0001X112.98112.9816.830.0004X23.9013.905.050.0337X333.92133.9243.98<0.0001X411.06111.0614.340.0009殘差Residual19.28250.77失擬項(xiàng)Lack of fit17.85200.893.120.1051純誤差Pure error1.4350.29總差Cor total81.1329R20.7624R2Adi0.7243

圖7殘差分布近似于直線，試驗(yàn)值多集中在殘差為0附近，并且直線兩端數(shù)值稀少，說明試驗(yàn)與殘差服從正態(tài)分布，從而反映該模型具有可靠性。

如圖8所示，依據(jù)紫蘇籽油提取率的回歸模型做出其等高線及響應(yīng)面圖，可以直觀地反映試驗(yàn)條件對(duì)油提取率的影響，響應(yīng)面變化越陡表示對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著[19]。結(jié)合圖形分析：響應(yīng)面圖形變化較陡，說明變化是均勻的，對(duì)提取率影響顯著[20]。

圖7 殘差正態(tài)概率分布Fig.7 Residual normal probability distribution

圖8 響應(yīng)面各因素之間相互作用立體圖Fig.8 Response surface interactions

2.5 最佳試驗(yàn)條件的確定與驗(yàn)證

通過Design Expert 8.0.6響應(yīng)面優(yōu)化軟件分析預(yù)測(cè)油提取率最佳條件為堿性蛋白酶在pH9.5條件下液(mL)固(g)比9.97∶1、加酶量2.75%、溫度56.1℃、時(shí)間5.25 h，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，紫蘇油平均提取率結(jié)果為37.65%，與理論值38.3%十分接近，表明此模型可用。

2.6 紫蘇籽油理化性質(zhì)分析

不同提取方式的紫蘇籽油脂理化指標(biāo)見表4，由表4可以看出水酶法提取的紫蘇籽各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，表明試驗(yàn)方法可行。

表4 紫蘇籽油的理化性質(zhì)

圖9 水酶法提取紫蘇籽油總離子流圖 1.棕櫚酸(C16∶0)；2.硬脂酸(C18∶0)；3.油脂酸(C18∶1)；4.亞油酸(C18∶2)；5.α-亞麻酸(C18∶3) 下同。Fig.9 Aqueous enzymatic extraction of Perilla seed oil total ion current map 1.Palmitic acid(C16∶0)；2.Stearic acid(C18∶0)；3.Fatty acid(C18∶1)；4.Linoleic acid(C18∶2)；5.Alpha linolenic acid(C18∶3) The same as below.

圖10 溶劑法提取紫蘇籽油總離子流圖Fig.10 Total ion flow diagram of Perilla seed oil extracted by solvent method

圖11 壓榨法提取紫蘇籽油總離子流圖Fig.11 Total ion flow chart of Perilla seed oil extracted by pressing method

紫蘇種子脂肪酸主要由5種成分組成，按出峰順序依次為棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油脂酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、α-亞麻酸(C18∶3)其中油酸、亞油酸和α-亞麻酸為不飽和脂肪酸。通過氣相色譜儀對(duì)紫蘇種子脂肪酸組成進(jìn)行分析，在總脂肪酸中，水酶法提取的紫蘇油脂中棕櫚酸(C16∶0)占7.1%，硬脂酸(C18∶0)占2.64%、油脂酸(C18∶1)9.95%，亞油酸(C18∶2)占13.06%，α-亞麻酸(C18∶3)占67.9%，溶劑法和冷榨法提取的油脂中α-亞麻酸含量分別為66.33%、67.26%，不及水酶法提取的相對(duì)含量高。

3 結(jié)論

最佳提取工藝參數(shù)堿性蛋白酶在pH9.5條件下液(mL)固(g)比9.97∶1、加酶量2.75%、溫度56.1℃、時(shí)間5.25 h，該條件下紫蘇油脂的提取率可達(dá)到37.65%，接近理論值38.3%，說明建立的模型合理有效。此工藝得出油脂的理化指標(biāo)較好，且具有提取率高、時(shí)間短、耗能少等優(yōu)點(diǎn)，為紫蘇籽油的高效、簡(jiǎn)便的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能，也為紫蘇籽有效的利用奠定了基礎(chǔ)。