冰凍切片技術(shù)在鐵皮石斛顯微結(jié)構(gòu)上的應(yīng)用

蔣素華 梁 芳 張 燕 周一冉 郭夢園 袁秀云 崔 波*

(1.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所，鄭州 450044； 2.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)，為多年生附生草本植物，有著藥用價值和悠久的使用歷史[1～2]。我國石斛屬植物共有74種[3]，而鐵皮石斛藥效最佳，但現(xiàn)存與鐵皮石斛近似的其他石斛物種就超過了20余種[4～5]。目前，鐵皮石斛植株及其根、莖、葉的提取物已被廣泛應(yīng)用于中藥、化妝品等領(lǐng)域，并有著深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。

鐵皮石斛具有典型的單子葉植物根的結(jié)構(gòu)，僅在細(xì)胞大小、層次及排列上有所變化[6]；鐵皮石斛的根無主根和側(cè)根之分，沒有根毛，根部有菌根真菌共生，與一般的營養(yǎng)根沒有根本差異，根由根被、外皮層、中皮層、內(nèi)皮層、韌皮部、木質(zhì)部、維管束和髓組成[7]。關(guān)于鐵皮石斛對根部切片的研究頗多，而其莖有著重要的藥用價值，所以對莖部的研究仍需推進(jìn)，莖主要由表皮、薄壁細(xì)胞和維管束組成，表皮細(xì)胞呈扁平狀，薄壁組織細(xì)胞大小區(qū)別顯著，相間排列，維管束為圓形或橢圓形，散布在基本組織中。鐵皮石斛葉片的形態(tài)特征及其結(jié)構(gòu)可以很好的反映它的生長特性，以及對溫度、光照、氧氣等周圍環(huán)境的表達(dá)和適應(yīng)性[8]?？偟膩碚f，對鐵皮石斛根、莖、葉顯微結(jié)構(gòu)的研究意義重大。因此，該實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的蔗糖保護(hù)—液氮速凍冰凍切片法觀察鐵皮石斛根、莖、葉的顯微結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的石蠟切片相比，冰凍切片具有用時短、簡便、易操作等優(yōu)點(diǎn)，并且有利于展開一些關(guān)于細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域的研究[9]。此技術(shù)解決了利用普通的石蠟切片觀察植物樣品時需要進(jìn)行浸透、失水、包埋等操作繁瑣、切片用時長的問題。冰凍切片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動物和人體的研究中[10]，但由于植物細(xì)胞組織的特殊性，如何在植物的研究中進(jìn)行應(yīng)用和推廣變得非常重要。目前，冰凍切片法僅應(yīng)用于對少數(shù)植物器官和組織切片的研究探索[11]。此外，冷凍后的植物材料因?yàn)橛写罅克值拇嬖?，會比動物材料的硬度大，進(jìn)而難以獲得較完整的切片，以及難以保持其組織結(jié)構(gòu)的完整性。一般來說，植物的莖部和葉片含水量都較大，而根部含水量相對較少[12]。所以，在以往的很多實(shí)驗(yàn)中，都很難看到完整的莖部和葉片的顯微結(jié)構(gòu)。冰凍切片的研究進(jìn)展由于還存在許多未知，所以也成為大家密切關(guān)注的研究動向。本研究利用光鏡和改進(jìn)的蔗糖保護(hù)—液氮速凍冰凍切片法，觀察鐵皮石斛根、莖、葉的顯微結(jié)構(gòu)。此方法在直接包埋法冰凍切片的基礎(chǔ)上，加入蔗糖保護(hù)液，抽真空，使材料失水，放入液氮中速凍1～2 min，然后才進(jìn)行包埋切片，減緩了植物材料在低溫環(huán)境的冷凍過程中可能出現(xiàn)的細(xì)胞破損、冰晶損傷。此研究將有助于蘭科植物相關(guān)基因的亞細(xì)胞定位工作的開展，在蘭科植物顯微結(jié)構(gòu)、原位雜交和組織化學(xué)研究中將具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 材料與方法

2.1 材料

分別取新鮮鐵皮石斛幼苗期的根、莖、葉作為實(shí)驗(yàn)材料。試驗(yàn)儀器包括LEICA CM1950冰凍切片機(jī)、顯微鏡DM2500(LEZCA)。試驗(yàn)試劑為液氮、蔗糖、磷酸緩沖液、OCT包埋劑。

2.2 冰凍切片方法的優(yōu)選

2.2.1 不同蔗糖保護(hù)液對冰凍切片效果比較

將切取的根分別浸泡在含有4%、8%、16%蔗糖溶液中1 h，分別用對應(yīng)相同蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的磷酸緩沖液進(jìn)行浸洗4～5次，每次2 min，然后抽真空，直到根沉到管底，之后便直接放到液氮中冷凍30 s，用OCT包埋劑在載物臺上直接包埋，-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度為厚度為15 μm，放進(jìn)樣品頭中開始切片，分別用干凈的載玻片展片，觀察、比較切片效果，莖和葉處理同上。

2.2.2 不同冷凝溫度對冰凍切片效果比較

將根、莖和葉分別于-15℃、-20℃、-25℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度為厚度為15 μm，分別用干凈的載玻片展片，觀察、比較切片效果。

2.2.3 不同切片厚度對冰凍切片的效果比較

根、莖和葉在-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度分別保持在10、15、20 μm，用干凈的載玻片展片，觀察，比較切片效果。

2.2.4 切片評價

切片制作過程中，分別從舒卷度、薄厚度、完整度以及顯微觀察效果四個方面來評價切片的效果，選出最佳切片進(jìn)行染色(表1)。

2.3 冰凍切片與觀察

將根浸泡在4%蔗糖的溶液中，在-25℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度20 μm；將莖固定在16%蔗糖的溶液中，在-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度15 μm；切取的葉片先固定在16%蔗糖的溶液中，在-20℃環(huán)境下冷凝10 min，切片厚度10 μm，分別用干凈的載玻片展片，染色、觀察切片效果。

表1 鐵皮石斛冰凍切片感官評價標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Sensory evaluation criteria for cryo-sectioning ofD.officinale

項(xiàng)目ProjectⅠ級ⅠclassⅡ級Ⅱ classⅢ級Ⅲ classⅣ級Ⅳ class伸卷度Stretch roll degree+++---厚薄度Thickness+++---完整度Integrity+++---顯微效果Effect of microstructure+++---

注：“+”表示切片較舒展、厚度較薄、完整度好以及顯微視覺效果清晰；“-”表示切片卷曲、厚度很厚、完整度差、顯微視覺效果不清晰且嚴(yán)重重疊或切片不完整。符號越多，相應(yīng)的效果越明顯。

Note:“+” means that slices were more stretched,thinner,more complete and had a clear microscopic visual effect. The more “+”,the better the result. “-” means that slices were curl,thickness,poor integrity,unclear microscopic visual effect and serious overlap or incomplete. The more “-”,the worse the result.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同蔗糖保護(hù)液液對冰凍切片的效果比較

分別比較了蔗糖保護(hù)液液質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為4%、8%、16%的切片效果(圖1)，根在蔗糖固定液濃度為8%時效果較好(圖1A)，細(xì)胞正常，無收縮，切片比較完整，能清晰地看到表皮、皮層、維管柱。莖在蔗糖固定液濃度為16%時效果較好(圖1B)，細(xì)胞有輕度收縮，切片薄且完整，能清晰地看到表皮、維管束以及薄壁細(xì)胞。葉在蔗糖固定液濃度為4%時效果較好(圖1C)，組織結(jié)構(gòu)清晰完整，輕度收縮，能觀察到上下表皮，葉肉細(xì)胞和維管束。植物細(xì)胞根、莖、葉含水量不同，根的含水量較莖和葉少，莖的含水量和葉片的含水量都很高，而蔗糖可以使其失水，所以根、莖、葉的最適蔗糖固定液濃度分別為8%、16%、4%(表2)。

圖1 不同蔗糖保護(hù)液對根、莖、葉冰凍切片的效果比較 A.根；B.莖；C.葉Fig.1 Comparison of effects of different sucrose preservatives on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

表2 不同濃度蔗糖保護(hù)液的比對

Table 2 Comparison and analysis of sucrose protective solutions with different concentrations

蔗糖保護(hù)液Sucrose protectiveliquid(%)完整度Integrity顯微效果Effect of microstructure根Root莖Stem葉Leaf根Root莖Stem葉Leaf4+------+8---+--16--++-+-

注：“++”表示Ⅰ 級；“+”表示Ⅱ級；“-”表示Ⅲ級；“--”表示Ⅳ級 下同。

Note:“++” express Ⅰclass; “+” express Ⅱ class; “-” express Ⅲ class; “--” express Ⅳ class The same as below.

3.2 不同冷凝溫度的冰凍切片效果比較

不同的冷凝溫度對植物組織的包埋穩(wěn)定度影響較大，根在-25℃時包埋穩(wěn)定度最高，切片時不粘連， 不粉碎， 不易卷縮； 莖和葉在-20℃時包埋

表3 不同冷凝溫度對冰凍切片效果比較

Table 3 Comparison of the effect of different condensing temperatures on cryo-sectioning

冷凝溫度Condensing temperature(℃)伸卷度Stretch roll degree根Root莖Stem葉Leaf-15----20++++-25+++-

穩(wěn)定度較高，切片時易伸展，不卷縮。分別比較了不同冷凝溫度下的切片效果(圖2)，根在冷凝溫度為-25℃時效果較好(圖2A)，能清晰地看到顯微結(jié)構(gòu)，如表皮、皮層及維管柱。莖在冷凝溫度為-20℃時效果較好(圖2B)，此時能清晰地看到莖的表皮、薄壁細(xì)胞和維管束。葉在冷凝溫度為-20℃時效果較好(圖2C)，圖片較完整，結(jié)構(gòu)較清晰(表3)。

圖2 不同冷凝溫度對根、莖、葉冰凍切片的效果比較 A.根；B.莖；C.葉Fig.2 Effects of different condensing temperatures on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

圖3 不同切片厚度對根、莖、葉冰凍切片的效果比較 A.根；B.莖；C.葉Fig.3 Effects of different section thicknesses on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

3.3 不同切片厚度的冰凍切片的效果比較

切片厚度直接影響組織的清晰度與完整度(表3)，經(jīng)過比較分析，根的切片厚度保持在20 μm時效果較好(圖3A)，此厚度下的根切片比較完整，結(jié)構(gòu)也清晰。莖在切片厚度保持在15 μm時效果較好(圖3B)，此厚度下的莖可以看到清晰地表皮、維管束、薄壁細(xì)胞。葉在切片厚度保持在15 μm時效果較好(圖3C)，此厚度下葉的顯微結(jié)構(gòu)效果較好，清晰且完整(表4)。

表4 不同切片厚度對冰凍切片效果比較

Table 4 Comparison of the effect of different slice thickness on cryo-sectioning

切片厚度Slice thickness(μm)厚薄度Thickness根Root莖Stem葉Leaf10---15++++20---

圖4 鐵皮石斛根的切片效果Fig.4 Effect of root section on D.officinale

3.4 冰凍切片與觀察

鐵皮石斛無主根和側(cè)根之分，根的橫切面從外到內(nèi)依次為根被、皮層和中柱。表皮細(xì)胞有3～5層細(xì)胞，其細(xì)胞多呈長筒形，呈45°輻射狀排列。根被主要起吸水、保護(hù)、透氣、減少內(nèi)部組織細(xì)胞水分流失的作用[13～15]。根被向內(nèi)是皮層組織，由15～16層細(xì)胞組成占整個根組織的絕大部分，皮層組織又分為三個皮層：外皮層，內(nèi)皮層、中皮層，根的中心部分稱為中柱，由韌皮部、維管束、木質(zhì)部和髓組成(圖4)。

鐵皮石斛莖直立多節(jié)、叢生、不分枝、呈圓柱形，通常長9～35 cm，粗3～5 mm，表皮細(xì)胞呈扁平狀，皮下層有1列長多角形的細(xì)胞，壁較厚。薄壁組織細(xì)胞大小區(qū)別顯著，相間排列，維管束為圓形或橢圓形，散布在基本組織中，木質(zhì)部和韌皮部構(gòu)成一束束的維管束，分散在薄壁細(xì)胞之間(圖5)。

鐵皮石斛葉的表皮細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，上表皮細(xì)胞較下表皮細(xì)胞大，葉肉組織分布均一，葉肉細(xì)胞含大量葉綠體，葉片為平行葉脈，葉脈為大維管束，維管束外均分布有一層小型薄壁細(xì)胞(圖6)。

圖5 鐵皮石斛莖的切片效果Fig.5 Effect of stem section on D.officinale

圖6 鐵皮石斛葉的切片效果Fig.6 Effect of leaf section on D.officinale

4 討論

冰凍切片可以縮短常規(guī)石蠟切片緩慢而復(fù)雜的處理過程，減少對樣品組織活性物質(zhì)的損傷，更好地保存生物分子活性，且具有快速、簡便、易操作等特點(diǎn)[16]。在實(shí)驗(yàn)中，采用改進(jìn)的蔗糖保護(hù)—液氮速凍冰凍切片法觀察鐵皮石斛根、莖、葉的顯微結(jié)構(gòu)，從而確定出鐵皮石斛根、莖、葉冰凍切片的最適條件：根在蔗糖固定液濃度為4%，冷凝溫度為-25℃，切片厚度保持在20 μm時效果較好；莖在蔗糖固定液濃度為16%，冷凝溫度為-20℃，切片厚度保持在15 μm時效果較好；葉在蔗糖固定液濃度為16%，冷凝溫度為-20℃，切片厚度保持在10 μm時效果較好。

植物細(xì)胞具有大液泡，植物細(xì)胞中大量的水分使植物樣品更容易在低溫冷凍過程中形成冰晶，損傷植物細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，即“冰晶損傷”[17]，對于植物組織來說，蔗糖是一種很好的固定液，蔗糖可以使植物細(xì)胞失水，液氮可以及時速凍，在細(xì)胞失水之后盡量減輕因冷凍造成的冰晶損傷；快速冷凍是解決這一問題的主要措施之一，而使用冷凍保護(hù)劑可以降低細(xì)胞內(nèi)溶液的冰點(diǎn)，減小形成冰晶的機(jī)會[18]。陳丹等[19]對煙草頂芽冰凍切片的研究表明，蔗糖濃度為40%時，雖然芽整體結(jié)構(gòu)保持較完整且分生組織不受影響，但分生組織周圍的薄壁細(xì)胞卻有不同程度收縮，本研究采用4%～16%的蔗糖濃度，得到了良好的效果。實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的蔗糖保護(hù)—液氮速凍冰凍切片法，對鐵皮石斛的根、莖、葉的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察、分析、總結(jié)，可進(jìn)一步為鐵皮石斛的結(jié)構(gòu)和植物學(xué)鑒定提供參考，同時也為蘭科基因組織差異表達(dá)和定位，以及原位雜交與組織化學(xué)染色提供冰凍切片的關(guān)鍵技術(shù)。