長白落葉松過氧化氫酶LoCAT1基因克隆及表達(dá)分析

白曉明 董實偉 楊宇寧 宋 躍 張含國 李淑娟

(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

植物在逆境脅迫下，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和積累會帶來的氧化逆境毒害。ROS不僅可以直接對體內(nèi)的大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA等)造成損傷，同時也作為信號分子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控和氧化還原調(diào)控等過程[1]。此外還通過破壞電子傳遞鏈來抑制光合、呼吸以及氮代謝等過程，進(jìn)而影響植物生長和發(fā)育[2]。在長期的進(jìn)化過程中，植物細(xì)胞形成了一套有效的抗氧化防御系統(tǒng)以維持細(xì)胞內(nèi)ROS的平衡，降低毒害作用。其中，過氧化氫酶(Catalase，CAT)在解除H2O2毒害的過程中發(fā)揮著重要的作用。

過氧化氫酶是抗氧化酶中首先被發(fā)現(xiàn)的，Loew將其命名為Catalase[3]，廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，在植物體內(nèi)主要存在于葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而在動物體主要存在肝和紅細(xì)胞中[4]。它能夠清除植物細(xì)胞內(nèi)光呼吸、線粒體電子傳遞及脂肪β-氧化等過程中產(chǎn)生的H2O2，從而保護(hù)細(xì)胞免于過氧化氫的毒害[5]，通過提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增強抗氧化代謝水平可以提高植物本身的抗逆性[6]。研究表明，過氧化氫酶基因在病害防御、脅迫應(yīng)答、延緩衰老等方面起著重要作用[7～9]，如轉(zhuǎn)過氧化氫酶基因KatG的棉花(Cotton)在干旱條件下生長優(yōu)良，顯著提高棉花的抗旱能力[10]，轉(zhuǎn)鹽穗木(Halostachyscaspica)過氧化氫酶基因HcCAT1的大腸桿菌，可明顯提高其耐鹽性[11]，過量表達(dá)的水稻(OryzasativaL.)過氧化氫酶基因OsCATb提高大腸桿菌對不同重金屬逆境脅迫的耐受性[12]。近年來研究者已陸續(xù)從煙草[13](Tobacco)、擬南芥[14](Arabidopsisthaliana)、冬棗[15](Ziziphusjujuba)、銀杏[16](GinkgobilobaL.)、絲瓜[17](Luffacylindrical)等多種植物中克隆出相關(guān)CAT基因，并對這些基因功能及表達(dá)特性進(jìn)行了研究。

長白落葉松(Larixolgensis)，又名黃花松，落葉喬木[17]，是北方和山地溫帶干燥寒冷氣候條件下寒濕型針葉林的主要樹種之一。長白落葉松以早期速生、適應(yīng)性和抗逆性強而著稱[18]，因此，它是進(jìn)行抗逆基因克隆和抗逆機制研究的理想材料。本研究以長白落葉松為材料，克隆獲得LoCAT1基因，運用生物信息學(xué)方法對其序列特征及編碼蛋白結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行預(yù)測分析，同時對不同組織在逆境脅迫下該基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，旨在初步探究該基因的功能，為揭示林木逆境響應(yīng)的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及脅迫處理

供試植物材料選自實驗室播種育苗的長白落葉松植株。選取6個月苗齡，生長狀態(tài)良好且長勢一致的長白落葉松植株分別進(jìn)行鹽脅迫和滲透脅迫處理。鹽脅迫處理方法：將長白落葉松植株轉(zhuǎn)移到含有200 mmol·L-1NaCl的水溶液中，根部避光培養(yǎng)；滲透脅迫處理方法：將長白落葉松植株轉(zhuǎn)移到含有40%(w/v)的PEG6000水溶液中，根部避光培養(yǎng)。以未處理的正常生長植株作為對照，處理12、24、48、96 h后，分別取各處理和對照長白落葉松的根、莖、葉，立即液氮冷凍處理，保存于-80℃?zhèn)溆弥杏糜赗NA提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 長白落葉松總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

采用CTAB法分別提取根、莖、葉及整株的RNA，用超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。根據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，分別以上述獲得的RNA為模板，在PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，于-20℃保存。

1.2.2 特異引物設(shè)計與克隆

從長白落葉松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得CAT1基因的全長序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計引物(表1)，引物由上海生工生物公司有限公司合成。以整株的RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，采用KOD-FX PCR酶進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：上下游引物各1.5 μL，模板cDNA 1 μL，KOD FX 1 μL，ddH2O 10 μL，2 mmol·L-1dNTPs 10 μL，2x PCR buffer for KOD FX 25 μL。擴增條件：94℃，2 min；98℃，10 s，58℃，30 s，68℃，55 s，35個循環(huán)；68℃，10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測并回收目的片段，將目的片段與pROK-Ⅱ載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，卡那霉素(50 mg·L-1)篩選陽性轉(zhuǎn)化子。PCR檢測后將陽性結(jié)果送上海生工測序。

表1 引物序列

1.2.3LoCAT1基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件對獲得的長白落葉松LoCAT1基因進(jìn)行核苷酸序列的分析，并檢測其編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列。利用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件分析LoCAT1蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)。利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線軟件分析LoCAT1蛋白質(zhì)親水疏水性。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast對LoCAT1氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對，然后選擇不同物種中的同源氨基酸序列。首先使用ClustalX對氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，再結(jié)合Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4LoCAT1基因的組織特異性表達(dá)檢測

根據(jù)LoCAT1的基因序列設(shè)計特異定量引物L(fēng)oCAT1-FQ及LoCAT1-RQ，以tubulin為內(nèi)參設(shè)計引物tubulin-F及tubulin-R(表1)，以1.2.1獲得的根、莖、葉cDNA為模板，進(jìn)行實時定量RT-PCR分析。體系如下：2xTransStart? TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL，LoCAT1-FQ/RQ混合引物(10.0 μmol·L-1)0.4 μL，cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye(50x)0.4 μL，加ddH2O至20 μL。RT-PCR反應(yīng)程序如下：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 35 s，40次循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，利用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

圖1 長白落葉松總RNA(A)和擴增產(chǎn)物電泳圖(B)Fig.1 The electrophoresis of total RNA in L.olgensis(A) and PCR production of LoCAT1(B)

圖2 LoCAT1基因序列及推測的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and predicted amino acid sequences of LoCAT1

2 結(jié)果與分析

2.1 長白落葉松總RNA的檢測及LoCAT1基因的克隆

提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，有明顯的18 s RNA、28 s RNA兩條條帶和微弱的5 s RNA彌散狀條帶，且28 s RNA的亮度為18 s RNA的兩倍(圖1A)，結(jié)果表明提取的總RNA質(zhì)量完好，可用于后續(xù)試驗。

以長白落葉松cDNA為模板，利用特異性引物對LoCAT1基因ORF序列進(jìn)行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示與預(yù)期目的片段954 bp大小基本一致(圖1B)，條帶清晰且無明顯拖尾。將菌液送至上海生工生物公司測序，結(jié)果表明：LoCAT1基因共含有954個堿基，編碼317個氨基酸(圖2)；LoCAT1基因克隆成功，可以進(jìn)行后續(xù)操作。

2.2 長白落葉松LoCAT1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 LoCAT1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

通過Protparam分析顯示，長白落葉松LoCAT1基因蛋白分子式為C1675H2520N456O477S13。對其所編碼氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：LoCAT1蛋白分子量為56.81 kD，含有帶負(fù)電的氨基酸(Asp+Glu)和帶正電的氨基酸(Arg+Lys)個數(shù)分別為44和40個，理論等電點(pI)為6.21，脂溶指數(shù)68.26，總平均親水系數(shù)為-0.640，不穩(wěn)定系數(shù)為33.42，說明該蛋白為穩(wěn)定的脂溶性親水蛋白。

2.2.2LoCAT1基因的同源性比較及進(jìn)化樹分析

根據(jù)Blast同源搜素結(jié)果，將長白落葉松LoCAT1氨基酸序列與GenBank登錄的北美云杉(Piceasitchensis)、銀杏(Ginkgobiloba)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、江南卷柏(Selaginellaemoellendorfii)、麻風(fēng)樹(Jatrophacarcas)、枇杷(Eriobotryajaponica)等12個物種氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，在比較的12個物種中，與北美云杉氨基酸序列相似性最高，達(dá)到93.7%，與枇杷的相似性最低，僅為68.1%(圖3)。用MEGA7.0軟件通過近臨相接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建蛋白序列的進(jìn)化樹，由系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，科屬親緣關(guān)系接近的植物歸納為同一類，預(yù)測長白落葉松和北美云杉的距離最為接近，和其他植物均相差較遠(yuǎn)，結(jié)果與植物系統(tǒng)分類一致(圖4)。

2.3 LoCAT1基因的組織特異性表達(dá)分析

以長白落葉松3個不同組織部位的cDNA為模板，通過RT-qPCR檢測分析各組織部位的相對表達(dá)量(圖5)。以LoCAT1基因在根中的相對表達(dá)量為參照，在葉中的表達(dá)量最高接近根的10倍，莖的表達(dá)量低于根。

圖4 LoCAT1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LoCAT1

圖5 LoCAT1基因組織特異性表達(dá)分析Fig.5 Tissue specific expression analysis of LoCAT1

2.4 LoCAT1基因在逆境脅迫下的表達(dá)模式

為了初步分析LoCAT1基因的逆境脅迫應(yīng)答功能，利用qRT-PCR技術(shù)分析了200 mmol·L-1NaCl、40%(w/v)PEG6000脅迫處理后長白落葉松根、莖、葉中LoCAT1基因相對表達(dá)情況。結(jié)果表明：在NaCl處理后，根和莖中LoCAT1基因在所有時間點均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，其中12 h時表達(dá)量最低，僅為對照的38%和64%。葉中LoCAT1基因表達(dá)在24 h明顯受抑制(僅為對照的24%)，隨后被上調(diào)表達(dá)，脅迫96 h時表達(dá)量最高，為對照的22倍(圖6)。PEG6000處理后，根和莖中LoCAT1基因的表達(dá)在脅迫早期被明顯抑制，隨后被上調(diào)表達(dá)。葉中LoCAT1基因的表達(dá)在所有時間點均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，隨著脅迫時間的延長LoCAT1基因的表達(dá)量逐漸增加，處理96 h時表達(dá)量最高，為對照的1.8倍(圖7)。這些結(jié)果初步顯示，高鹽和滲透等非生物脅迫能夠顯著誘導(dǎo)LoCAT1基因的表達(dá)，由此推測該基因可能參與長白落葉松的逆境響應(yīng)過程。

圖6 NaCl脅迫處理下LoCAT1在長白落葉松根、莖、葉中的相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression of LoCAT1 in L.olgensis root, stem and leaf with the treatment of NaCl

圖7 PEG脅迫處理下LoCAT1在長白落葉松根、莖、葉中的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of LoCAT1 in L.olgensis roots,stems and leaves with the treatment of PEG

3 討論

植物在逆境脅迫下，過氧化氫酶對抵抗活性氧毒害發(fā)揮重要作用，該酶通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS穩(wěn)態(tài)，在植物的生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。本研究從長白落葉松中克隆得到LoCAT1基因，選取北美云杉等12種植物的CAT氨基酸序列進(jìn)行多序列比對與進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，CAT蛋白氨基酸序列保守性較高。

CATs家族基因的分子表達(dá)特性與其所調(diào)控的植物生理代謝過程關(guān)系密切。在煙草中CAT1基因在葉內(nèi)表達(dá)量高，CAT3基因主要在種子內(nèi)表達(dá)，CAT2基因的表達(dá)受紫外、臭氧及病原誘導(dǎo)[20]；南瓜(Pumpkin)CAT1基因在種子和幼苗發(fā)育早期表達(dá)，與衰老有關(guān)，CAT2基因在上胚軸和成熟葉內(nèi)表達(dá)，而CAT3基因在下胚軸和根中表達(dá)[21]；擬南芥CAT1基因、CAT2基因和CAT3基因在花序和種子內(nèi)都表達(dá)，且CAT2基因和CAT3基因在葉中表達(dá)量高[22]；蓖麻(Castor)CAT1基因主要在胚乳和胚軸中表達(dá)[23]。本研究通過RT-PCR對LoCAT1基因在長白落葉松的不同組織部位表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，LoCAT1基因在長白落葉松的根、莖、葉中都有表達(dá)，LoCAT1基因在葉組織中表達(dá)量最高，根次之，莖表達(dá)量最低。在葉片中高度表達(dá)，揭示LoCAT1可參與催化葉片光呼吸中產(chǎn)生的H2O2的分解作用，使機體免受H2O2的毒害，而相對于地下部的光呼吸產(chǎn)生的H2O2的清除則可能與其他同源基因的表達(dá)有關(guān)。

植物CAT基因的表達(dá)不僅具有組織器官的特異性，而且能夠被逆境脅迫如低溫、高溫、鹽害、干旱等誘導(dǎo)表達(dá)。例如，煙草和銀杏在高鹽和干旱的脅迫下，CAT1基因表達(dá)量上調(diào)，參與植物抵御逆境脅迫[13,16]。高羊茅FaCAT1基因在植株葉片受到高鹽處理4 h后時，F(xiàn)aCAT1基因的表達(dá)量增加到最大[24]，來清除活性氧造成的損害。干旱脅迫可使玉米CAT活性升高，從而減輕膜脂過氧化傷害，使玉米對干旱產(chǎn)生一定的抗性[25]。在本研究中，長白落葉松在非生物逆境脅迫下，LoCAT1基因的表達(dá)量都發(fā)生了明顯改變，由此推測表明長白落葉松LoCAT1基因可能參與了滲透和耐鹽脅迫的應(yīng)答，但參與的調(diào)控途徑不同。在后續(xù)研究中我們將繼續(xù)對LoCAT1基因在長白落葉松抗逆過程中的具體功能和作用機制進(jìn)行分析。