84K楊PagC3H3基因表達(dá)模式分析

樊二勤 劉彩霞 付鵬躍 楊傳平 曲冠證

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

木質(zhì)素是維管植物中的重要大分子物質(zhì)，與纖維素、半纖維素縱橫交錯(cuò)形成次生細(xì)胞壁[1～2]。木質(zhì)素不但對(duì)維管運(yùn)輸和植物機(jī)械支撐起重要作用，而且在植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)及抵抗生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮作用[3～8]。木質(zhì)素作為木材的主要組成成分，在林木的生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有非常重要的作用。木質(zhì)素是復(fù)雜的苯丙烷類單體聚合物，通常是由3種單體聚合而成，3種單體分別為p-coumaryl(H型，20)，coniferyl(G型，22)和sinapyl(S型，24)alcohols(圖1)。在雙子葉植物中，木質(zhì)素主要是由S型，G型和少量的H型以及其它中間的代謝產(chǎn)物聚合而成[9]。在楊樹中，S型和G型木質(zhì)素單體比值大約為2∶1[10]。

圖1 楊樹中各種酶參與的木質(zhì)素單體的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of lignin monomer involved in various enzymes in poplar

木質(zhì)素是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物之一，在生物合成中涉及到許多重要的酶參與。其中對(duì)-香豆酸3-羥化酶(p-coumarate 3-hydroxylase,C3H)屬于細(xì)胞色素P450單氧化酶，是在對(duì)-香豆酰輔酶A(p-coumaroyl CoA)到咖啡酰輔酶A(caffeoyl CoA)的羥基化過程和G/S單體形成中的關(guān)鍵控制酶類[11]。2001年Schoch和Franke等從擬南芥中分離并定位到C3H基因，證明C3H有可能是木質(zhì)素合成中重要的中間代謝物質(zhì)[12～13]；Abdulrazzak等人又獲得擬南芥突變體，其生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，木質(zhì)素組成也與REF8基因突變體相似，進(jìn)一步證明了CYP98A3為編碼C3H的基因。

一直以來，國(guó)內(nèi)外對(duì)C3H作為關(guān)鍵的木質(zhì)素合成調(diào)控酶的研究集中在草本植物和裸子植物上，主要是提高紙漿獲得率及飼料消化率[14～18]，而對(duì)于林木中的C3H研究甚少，為探究其在楊樹中的表達(dá)模式，本文以84K楊為研究對(duì)象，通過探究PagC3H3基因在84K楊不同組織中的特異性表達(dá)來解析該基因的表達(dá)模式；再者，啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要組成部分，克隆啟動(dòng)子序列是了解基因表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵，目前對(duì)楊樹中C3H基因啟動(dòng)子的功能研究報(bào)道較少，本文根據(jù)已公布的楊樹基因組，從84K楊中克隆PagC3H3基因的啟動(dòng)子序列，構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，瞬時(shí)侵染擬南芥，GUS染色表明該啟動(dòng)子具有時(shí)空特異性表達(dá)的特征，同時(shí)表明該啟動(dòng)子調(diào)控PagC3H3基因在木質(zhì)素合成中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaCol-0)和84K楊(Populusalba×P.grandulos)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 菌株及主要試劑

大腸桿菌(Esherichiacoli)Trans1-T1感受態(tài)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；pBI121載體由本實(shí)驗(yàn)保存；pEASY-T1 Clonging Vector購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技(Bioer)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)(BioTeke)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑、限制性內(nèi)切酶、LATaq酶、dNTP Mixture、DNA Ligation Kit、DNA Marker等均購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 84K楊PagC3H3基因組織特異性表達(dá)分析

為了檢測(cè)84K楊PagC3H3基因在不同組織的表達(dá)水平，選取溫室內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)基本一致，株高為1.2 m的3株五月齡84K楊，分別取頂芽、頂部莖節(jié)、中部莖節(jié)、基部莖節(jié)、幼葉、功能葉、根7個(gè)組織部位。利用BioTeke公司通用植物總RNA提取試劑盒對(duì)84K楊不同組織的Total RNA進(jìn)行提取，操作方法參照試劑盒說明書。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將質(zhì)量完好的84K楊不同組織的Total RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋5倍作為定量PCR檢測(cè)的模板，以毛果楊Ptractin基因作為內(nèi)參基因，引物序列如下：Ptractin-RT-F(5′-AATACCCCATTGAGCACGG-3′)/Ptractin-RT-R(5′-ACTCACACCATCACCAGAATC-3′)，檢測(cè)目的基因在不同組織的表達(dá)量，所用的定量PCR引物為：PagC3H3-RT-F(5′-TCAGGCTACTTCCATTTGGTG-3′)/PagC3H3-RT-R(5′-AATTTCCTCTGGCTTCACTCC-3′)。反應(yīng)程序按照機(jī)器(Applied Biosystems 7500)設(shè)置進(jìn)行，反應(yīng)完成后，將定量PCR數(shù)據(jù)導(dǎo)出，利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1.3.2 84K楊PagC3H3啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)Phytozome網(wǎng)站上公布的毛果楊基因組信息，查找PtrC3H3基因上游的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列如下：PagC3H3-pro-F(5′-ATCAAGCTTCGTGTCAATTTATTCAACATTCTTAC-ACACAC-3′)/PagC3H3-pro-R(5′-ATCTCTAGATGTGGAGAGAAAAAATAAAAATTGGAAGAGAAAG-GG-3′)。以84K楊組培苗葉片為DNA提取的材料，利用本實(shí)驗(yàn)室改良的CTAB法[19]提取84K楊基因組DNA，根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，PCR程序結(jié)束后將PCR產(chǎn)物全部進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，并根據(jù)操作手冊(cè)將純化后的片段連入pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，對(duì)獲得的單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得條帶大小與目標(biāo)一致的陽性克隆，并送至擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，將測(cè)序檢測(cè)正確的陽性克隆命名為pEASY-PagC3H3-promoter。

1.3.3 pBI121-PagC3H3pro::GUS載體構(gòu)建及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

將測(cè)序正確的單克隆，在液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Bioer公司的質(zhì)粒提取試劑盒分別對(duì)pEASY-PagC3H3-promoter和pBI121這兩種載體進(jìn)行質(zhì)粒提取，利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，并分別膠回收目的片段，利用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，對(duì)獲得的單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得條帶大小與目標(biāo)一致的陽性克隆，并送至擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，將陽性克隆命名為pBI121-PagC3H3pro::GUS。選取測(cè)序驗(yàn)證正確的菌液提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，并對(duì)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌長(zhǎng)出的單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法過程如下：培養(yǎng)2周齡的擬南芥幼苗放到OD600=0.3且含有1/2MS、40 μmol·L-1AS、0.002 mg·L-1TDZ的農(nóng)桿菌侵染液中，于28℃，180 r·min-1搖床中共培養(yǎng)2 d[20]。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥的組織特異性觀察：對(duì)2 d后的擬南芥進(jìn)行GUS染色觀察，具體步驟如下：將瞬時(shí)轉(zhuǎn)化完成后的擬南芥轉(zhuǎn)移到GUS染液中，避光，抽真空處理，使其中的氣體全部溢出，置于37℃水浴鍋中過夜溫育，次日將染色的材料放于卡諾固定液中脫色，期間及時(shí)更換固定液，最后將脫色的材料放入培養(yǎng)皿中，通過實(shí)體顯微鏡觀察GUS染色情況，并分析該啟動(dòng)子的組織表達(dá)特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PagC3H3在84K楊不同組織表達(dá)分析

為了探究PagC3H3基因在84K楊不同組織中的表達(dá)特異性，分別提取同一植株的頂芽、頂部莖節(jié)、中部莖節(jié)、基部莖節(jié)、幼葉、功能葉、根等組織的Total RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)PagC3H3的基因的表達(dá)水平，同時(shí)以Ptractin基因作為內(nèi)參，結(jié)果如圖2所示，表明PagC3H3基因在不同組織中均有表達(dá)，且在根、中部莖節(jié)和基部莖節(jié)中表達(dá)量較高，在頂芽、頂部莖節(jié)、幼葉和功能葉中表達(dá)量較低，上述結(jié)果表明PagC3H3基因在木質(zhì)化程度高的組織中高表達(dá)。

2.2 PagC3H3基因啟動(dòng)子序列克隆及分析

提取84K楊葉片DNA作為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，條帶大小與預(yù)期目標(biāo)一致(圖3A)，切膠回收連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，對(duì)單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖3B)，將獲得的陽性克隆命名為pEASY-PagC3H3-promoter，并送至擎科生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明上述目的片段是84K楊PagC3H3基因上游的啟動(dòng)子序列。利用PlantCARE在線軟件對(duì)PagC3H3啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，在上游啟動(dòng)子區(qū)域長(zhǎng)2 035 bp(圖4)范圍內(nèi)含有多種順式作用元件，涉及多個(gè)生物學(xué)功能，具體包括以下幾類(表1)：光響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子作用元件、核心啟動(dòng)子元件、分生組織響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件及MEJA反應(yīng)響應(yīng)元件。

圖2 PagC3H3在84K楊不同組織表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of PagC3H3 in different tissues of P.alba×P.grandulos

圖3 pEASY-PagC3H3-promoter載體的構(gòu)建A.PagC3H3啟動(dòng)子的克隆：M. DNA marker DL5000；1. PagC3H3啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 B. pEASY-PagC3H3-promoter載體在大腸桿菌菌液中的PCR檢測(cè)：M. DNA marker DL5000；1～3. pEASY-PagC3H3-promoter菌液PCR檢測(cè)Fig.3 The construction of pEASY-PagC3H3-promoter vector A. The cloning of PagC3H3 promoter: M. DNA marker DL5000; 1. PCR amplification product of PagC3H3 promoter B. PCR detection of pEASY-PagC3H3-promoter vector in E.coli: M. DNA marker DL5000; 1-3. PCR detection of pEASY-PagC3H3-promoter vector

圖4 84K楊PagC3H3啟動(dòng)子序列Fig.4 Sequence of the PagC3H3 promoter in P.alba×P.grandulos

圖5 pBI121載體圖譜Fig.5 pBI121 vector map

2.3 pBI121-PagC3H3pro::GUS載體構(gòu)建

植物表達(dá)載體pBI121含有GUS融合蛋白系統(tǒng)，參照載體圖譜(圖5)，將PagC3H3啟動(dòng)子序列連接到pBI121上，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-PagC3H3pro::GUS。利用HindⅢ和XbaⅠ這兩種限制性內(nèi)切酶分別對(duì)pBI121和pEASY-PagC3H3-promoter質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將目的片段進(jìn)行切膠回收，通過DNA Ligation Kit連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖6A)，獲得條帶大小與目標(biāo)一致的陽性克隆，將其菌液送至擎科生物公司測(cè)序。

選取測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖6B)， 結(jié)果顯示單克隆均為陽性并命名為GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS，該結(jié)果表明植物表達(dá)載體構(gòu)建完成。

表1 PagC3H3啟動(dòng)子順式作用元件列表

圖6 pBI121-PagC3H3pro::GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建 A. pBI121-PagC3H3pro::GUS載體在大腸桿菌菌液中的PCR檢測(cè)：M. DNA marker DL5000；1～6.pBI121-PagC3H3pro::GUS菌液PCR檢測(cè)；7.陰性對(duì)照 B. pBI121-PagC3H3pro::GUS載體在農(nóng)桿菌(GV3101)菌液中的PCR檢測(cè)：M. DNA marker DL5000；1-8. GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS菌液PCR檢測(cè)；9.陰性對(duì)照Fig.6 The construction of pBI121-PagC3H3pro::GUS plant expression vector A. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS vector in E.coli; M. DNA marker DL5000; 1-6. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS; 7. Negative control B. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS vector in Agrobacterium tumefaciens(GV3101): M. DNA Marker DL5000; 1-8. PCR detection of GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS; 9. Negative control

2.4 擬南芥瞬時(shí)轉(zhuǎn)化及GUS活性檢測(cè)

將兩周齡的擬南芥幼苗浸泡在GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS的農(nóng)桿菌菌液中，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，經(jīng)GUS染色，脫色處理后，在實(shí)體顯微鏡下觀察GUS活性，結(jié)果如圖7所示，在下胚軸和根中GUS活性較強(qiáng)。推測(cè)84K楊PagC3H3啟動(dòng)子調(diào)控下游基因在木質(zhì)化程度高的組織中強(qiáng)烈表達(dá)。

圖7 PagC3H3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS在擬南芥中的GUS染色Fig.7 GUS staining driven by the PagC3H3 promoter in Arabidopsis

3 討論

木材是制漿造紙、房屋建造以及家具制作的重要原料，在社會(huì)生產(chǎn)中扮演著一個(gè)不可或缺的角色，因此培育出適合于林業(yè)相關(guān)產(chǎn)業(yè)加工與利用的優(yōu)良林木品種是林木工作者的重要目標(biāo)。木材的纖維素與木質(zhì)素含量是影響木材加工與利用的重要因素，木質(zhì)素作為植物體內(nèi)僅次于纖維素的一類重要高分子化合物，不僅具有重要的生物學(xué)功能，還是一種重要的能源物質(zhì)。如在造紙生產(chǎn)中，高木質(zhì)素含量就是影響紙漿產(chǎn)量和紙張質(zhì)量的不利因素之一，此外木材中的Guaiacyl型木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)由于更難以加工會(huì)降低紙漿的產(chǎn)率[21]。

對(duì)Guaiacyl型木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)、Syringyl型木質(zhì)素(S-木質(zhì)素)合成的關(guān)鍵基因C3H3的研究，有助于了解該基因在調(diào)節(jié)木材中3種木質(zhì)素單體的含量、組成及結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮的重要作用，有研究表明：當(dāng)coumarate 3-hydroxylase(C3H)在雜交楊中被降低后，木質(zhì)素含量降低，并且H型木質(zhì)素增加以及S/G型木質(zhì)素的比值上升[22]。

啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的位于基因上游的一段DNA序列。植物啟動(dòng)子通常包含TATA框、CAAT框和GC框，同時(shí)該區(qū)域還存在各種控制元件[23]，通過RNA聚合酶的識(shí)別、結(jié)合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過程，從而在植物基因表達(dá)調(diào)控過程中起到重要作用[24～25]。啟動(dòng)子決定基因表達(dá)的時(shí)空特異性，可以為分析基因調(diào)控提供重要信息。由此通過研究啟動(dòng)子的特性，用于分析下游基因的表達(dá)特異性，有助于了解植物生長(zhǎng)發(fā)育的過程及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)情況，從而能夠更好的控制外源基因高效、穩(wěn)定、長(zhǎng)期的在目的部位表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)以廣泛被應(yīng)用的用材樹種84K楊為研究對(duì)象，初步探究了84K楊PagC3H3基因的表達(dá)模式，對(duì)PagC3H3基因在84K楊不同組織中的特異性表達(dá)進(jìn)行了分析，并對(duì)PagC3H3啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆及功能驗(yàn)證，證明了PagC3H3基因在木質(zhì)化程度高的部位表達(dá)量高，也表明該啟動(dòng)子存在時(shí)空特異性表達(dá)的特征，由此推測(cè)該基因的表達(dá)模式為在木質(zhì)化程度高的組織中高表達(dá)，暗示該基因在木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮作用。該研究對(duì)于PagC3H3基因功能的解析，涉及較少，例如該基因在調(diào)控木質(zhì)素合成過程中是如何影響木材形成中的生長(zhǎng)性狀，如何利用該基因在木質(zhì)素合成中發(fā)揮的作用來調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成量及結(jié)構(gòu)(木質(zhì)素單體S/G比例)，從而對(duì)84K楊木材的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)；其次，林木中C3H3啟動(dòng)子是如何準(zhǔn)確調(diào)控C3H3基因在木質(zhì)素合成中行使功能，還有待進(jìn)一步的探究，期待在林木中對(duì)C3H3基因的功能做出更詳細(xì)的闡述。