橡膠籽苗莖腐病原菌鑒定

蔣桂芝，田 海，陶建祥

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪666100；2.云南天然橡膠產(chǎn)業(yè)集團江城有限公司，云南普洱665907）

目前橡膠樹種苗繁育主要采用籽苗芽接的方法，育苗期比過去的實生苗芽接縮短1年左右。2018年6月，云南景洪橡膠育苗大棚橡膠樹籽苗出現(xiàn)莖腐?。呵o病部變黑、壞死還有凝膠，與疫霉（Phytophthorade Bary)引起的橡膠樹季風性落葉病葉柄癥狀極為相似（圖1a）。為準確識別和防治病害，筆者進行了病原分離鑒定，現(xiàn)將鑒定結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

病原材料：采自云南省熱帶作物科學研究所橡膠研究中心育苗大棚內的籽苗病莖。

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g，水 1 000 mL。

瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂17 g，水1 000 mL。

皮氏培養(yǎng)液：Ca（NO3）20.4 g，KH2PO40.15 g，Mg（NO3）20.15 g，CaCl 0.06 g，蒸餾水 1 000 mL。

圖1 植株田間感病癥狀、接種癥狀

試驗接種材料：由云南省熱帶作物科學研究所橡膠研究中心提供，為培育10個月生長正常的云研77-4籽苗。

1.2 方法

1.2.1 病原分離

切取長度為5 cm左右的感病組織，經(jīng)75%酒精表面消毒后，用滅菌刀片切取大小（3～5）mm×（3～5）mm病健交界組織，置于PDA平板上，在25℃室溫下培養(yǎng)3 d。長出菌落后，用滅菌針挑取少量菌絲置于另一個PDA平板上，在25℃室溫下培養(yǎng)5 d形成菌落，再從中挑取少量菌絲置于瓊脂平板上，在25℃室溫下培養(yǎng)36 h，顯微鏡下進行單菌絲分離，在25℃室溫下培養(yǎng)5 d得到純培養(yǎng)菌，用于致病性測試和形態(tài)鑒定。

1.2.2 致病性測試

培養(yǎng)好的菌種用滅菌刀片劃成大小約5 mm×5 mm的菌塊備用。將準備好接種的橡膠籽苗莖干用自來水清洗1次，待莖干上的水分干后，用大頭針在莖干上扎3個小孔，品字排列，孔距3～5 mm，然后將備好的菌塊有菌絲的一面貼在小孔上，用無菌濕棉保濕2 d，5～7 d后觀察接種點感病情況。當接種點出現(xiàn)與田間一致的感病癥狀后再進行病原分離，得到與接種菌一致的菌即確認為病原菌。

1.2.3 病原鑒定

根據(jù)菌落和孢子囊的形態(tài)特征、適宜溫度，并參照《疫霉菌及其研究技術》等資料進行鑒定。

1.2.3.1 菌落形態(tài)

將純培養(yǎng)菌轉接到新PDA平板上，在25℃室溫、自然光照條件下培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)。

1.2.3.2 厚垣孢子形成

將接有病原菌的PDA平板置于25℃、室內RH65%、自然光照下培養(yǎng)10～15 d，觀察原垣孢子的形成。

1.2.3.3 孢子囊形成

將凹面玻片用75%的酒精表面消毒，涼干備用。用滅菌針挑取大?。?～3）mm×（2～3）mm的菌塊置于玻片的凹面中，在凹面中加入約3 mL的皮氏培養(yǎng)液，將載有菌塊的玻片置于28℃、自然光照下在培養(yǎng)缸保濕培養(yǎng)1～2 d，觀察孢子囊的形成及形態(tài)特征。

1.2.3.4 適宜生長溫度測試

將純培養(yǎng)菌株擴繁后，用滅菌打孔器打成直徑5 mm的菌絲塊，將菌絲塊接種在PDA平板上，接種好的PDA 平板分別置于溫度為 5、10、15、20、25、30、33、37℃，RH 80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每個處理5皿。5 d后用數(shù)顯卡尺測量菌落生長直徑，依據(jù)各處理菌落生長量確定病原菌的適宜溫度。

2 結果與分析

2.1 病原分離

分離樣本8個，均得到形態(tài)一致的白色菌落，用滅菌針挑取菌絲鏡檢，確定所得菌落均為同一真菌。選取1個菌落為代表菌進行單菌絲分離培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌，編號為XJZM20180627，用于致病性測試和病原鑒定。

2.2 致病性測試

籽苗莖上接種5 d后，在接種部位均出現(xiàn)與田間感病一致的癥狀（圖1b），經(jīng)病原的再分離得到與接種菌一致的菌，確認為病原菌。

2.3 病原鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)

PDA平板上的氣生菌絲生長旺盛，菌落白色（圖2a、圖2b），菌絲無色，粗細均勻，菌絲無隔，寬度4.1～5.2 μm。菌絲未見膨大。

圖2 X J Z M 2 0 1 8 0 6 2 7菌落形態(tài)、孢子囊和孢子囊梗、厚垣孢子

2.3.2 厚垣孢子形成

在25℃、室內RH65%、自然光照下培養(yǎng)10 d，鏡檢觀察到有厚垣孢子形成，厚垣孢子球形、近球形，頂生或間生，直徑25～38 μm（圖2c）。

2.3.3 孢子囊形態(tài)特征

在25℃、皮氏培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h產(chǎn)生孢子囊。孢子囊梗簡單合軸分枝，粗2.5～5.2 μm；孢子囊多為梨形、卵形、近圓形，少數(shù)橢圓形，大?。?3～58）μm×（30～40）μm，長寬比 1.1～1.9。孢子囊脫落，具短柄，柄長1.5～4.3 μm。孢子囊乳突突起明顯，單乳突，偶見雙乳突（圖2d）。

2.3.4 適宜生長溫度測試

在 5、10、15、20、25、30、33、37℃，RH 80%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，得到不同溫度菌絲生長曲線（圖3），可以看出，菌絲生長范圍為10～33℃，適宜生長溫度15～30℃，最適生長溫度為20～25℃，最高生長溫度＜33℃。

圖1 不同溫度下菌絲生長曲線

根據(jù)菌落、孢子囊形態(tài)及橡膠籽苗上的病狀，比較鄭小波［1］、余永年等［2］的文獻描述，鑒定該病原菌為棕櫚疫霉Phytophthora palmivoraButler。

3 小結

棕櫚疫霉P.palmivora是在熱區(qū)廣泛分布的疫霉種，能引起橡膠樹［3］及多種熱帶作物重要病害［4-6］。充分的高濕環(huán)境是疫霉病發(fā)生和流行的必要條件，橡膠籽苗大棚栽培就具備這樣的條件。因此，本病的防治應注意：1）適時調整、降低大棚內的水分和相對濕度；2）及時清除病苗；3）必要時對病區(qū)籽苗可噴霧甲霜靈、甲霜·霜霉威、疫霉凈等農藥，能有效控制本病的發(fā)生。