基于Schiff堿結(jié)構(gòu)的香豆素類熒光探針的合成及對(duì)Mg2+的識(shí)別

楊文生， 楊 菀， 馬亞軍

(榆林學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 榆林 719000)

1 引 言

鎂元素是生命過(guò)程中必不可少的生物離子[1-2]，在生命體中以二價(jià)離子的形式存在，廣泛分布在人體的各種細(xì)胞及身體器官中。鎂離子參與了人體的多種生理活動(dòng)[3]，比如細(xì)胞的增殖、生物酶反應(yīng)、構(gòu)建轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)及DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[4]等。鎂離子在細(xì)胞功能中起著關(guān)鍵作用，它的缺失將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。成年人每日攝入鎂的量應(yīng)達(dá)到300 mg，其來(lái)源主要為海鮮、蔬菜、奶制品及全谷類[5]。鎂離子攝入量過(guò)多或缺乏均會(huì)導(dǎo)致各種疾病[6-7]。當(dāng)鎂離子在人體內(nèi)含量超標(biāo)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂并對(duì)骨骼、胃腸道、神經(jīng)元及腎臟造成危害[8]。而鎂離子在人體內(nèi)長(zhǎng)期以低濃度存在時(shí)，往往導(dǎo)致糖尿病、心臟病、低鈣血癥、骨質(zhì)疏松癥等疾病[9-10]。此外，鎂離子還是植物體內(nèi)葉綠素的重要組成部分，參與了植物所需的光合作用，因而對(duì)于維持生物的正常生長(zhǎng)具有非常重要的作用。因此，我們很有必要尋找一種快速有效地檢測(cè)生物系統(tǒng)和環(huán)境中的鎂離子的方法。

檢測(cè)鎂離子常用的手段主要有EDTA滴定法、同位素質(zhì)譜法、原子吸收分光光度法、離子層析法及鎂試劑比色法等[11]。與這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比較，熒光探針?lè)ň哂羞x擇性和靈敏度高、可實(shí)時(shí)檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單、測(cè)試速度快及成本比較低等優(yōu)勢(shì)，因而引起了研究人員的廣泛關(guān)注[12-13]。近年來(lái)，鎂離子熒光探針已有大量報(bào)道，然而大多數(shù)報(bào)道的鎂離子熒光探針難以區(qū)分鎂離子和鈣離子，主要是由于鎂離子與鈣離子化學(xué)性質(zhì)很相似，造成不能高選擇性地識(shí)別鎂離子。

本文所合成的新型熒光探針具有能夠高選擇性識(shí)別鎂離子而不受鈣離子影響的特點(diǎn)，采用常規(guī)手段核磁譜及質(zhì)譜表征了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和組成，通過(guò)一系列分析測(cè)試方法研究了該探針的光譜性質(zhì)及反應(yīng)機(jī)理。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

Hitachi F-7000熒光光譜儀，日本日立公司；Bruker 400 MHz核磁共振儀，瑞士布魯克公司；Bruker Esquire 6000 質(zhì)譜儀，德國(guó)布魯克公司；XT4-100X顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，北京電光儀器廠。

7-羥基香豆素、2-氨基苯并咪唑、冰乙酸、六次甲基四胺、無(wú)水甲醇(AR，國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；NaNO3、KNO3、LiNO3、AgNO3、Pb(NO3)2、Al(NO3)3、Ba(NO3)2、Hg(NO3)2·H2O、Cd(NO3)2·4H2O、Co(NO3)2·6H2O、MnCl2·4H2O、Cu(NO3)2·3H2O、Ni(NO3)2·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O、Mg(NO3)2·6H2O、Cr(NO3)3·9H2O、Ca(NO3)2·4H2O(AR，上海阿拉丁試劑有限公司)。

實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為AR。實(shí)驗(yàn)所用蒸餾水為二次蒸餾制得。金屬離子儲(chǔ)備液均由金屬硝酸鹽和水合金屬硝酸鹽制備得到。

2.2 探針的合成

圖1為探針L的合成路線。

圖1 探針L的合成路線

2.2.1 中間體I的合成

準(zhǔn)備好250 mL的單口圓底燒瓶，加入5 g 7-羥基香豆素和50 mL冰乙酸，隨后加入10 g六次甲基四胺，放入磁子并攪拌均勻，設(shè)置加熱溫度為95 ℃，開(kāi)始加熱回流約6 h，將反應(yīng)物稍微冷卻后加入75 mL的20%鹽酸，重新調(diào)節(jié)溫度為60 ℃，在該溫度下加熱回流30 min。將反應(yīng)產(chǎn)物自然冷卻后用乙醚進(jìn)行萃取，將萃取后的澄清有機(jī)溶液合并到錐形瓶中，加入適量的無(wú)水Na2SO4，用玻璃棒充分?jǐn)嚢柽M(jìn)行干燥，然后過(guò)濾，將濾液濃縮后得到黃色的固體產(chǎn)物，再進(jìn)行重結(jié)晶操作，真空干燥后得到1.56 g淡黃色固體，即為中間體I，產(chǎn)率27%，熔點(diǎn)188.3～189.4 ℃。

2.2.2 探針L的合成

在干凈的250 mL的單口圓底燒瓶中，加入0.27 g 2-氨基苯并咪唑與35 mL無(wú)水甲醇，在80 ℃加熱回流，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?。取干凈的小燒杯，加?.38 g 中間體I與50 mL無(wú)水甲醇，用玻璃棒攪拌使其溶解完全。然后用滴管逐滴將小燒杯中的溶液移入圓底燒瓶中。加熱回流不久，析出大量沉淀。繼續(xù)回流24 h，將反應(yīng)物自然冷卻后減壓濃縮至最初的20%，然后過(guò)濾，用冷的無(wú)水甲醇淋洗兩次，真空干燥后得到0.27 g棕紅色固體粉末，即為探針L，產(chǎn)率44%，熔點(diǎn)291.3～292.5 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ13.02(s, 1H), 10.39(s, 1H), 9.93(s, 8H), 8.05～7.91(m, 9H), 7.80(d,J=8.7 Hz, 9H), 7.57(s, 11H), 7.27～ 7.10(m, 19H), 7.02～6.88(m, 10H), 6.55(s, 1H), 6.37(d,J=9.5 Hz, 8H), 3.46 (d,J=7.0 Hz, 1H)。13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ164.74,160.02,155.50,152.92,145.03,134.92,122.96,120.15,114.53,112.83,111.92,111.48,106.88。ESI-MS：m/z306.5[M+H]+。

2.3 光譜測(cè)試

稱取適量探針移入容量瓶中，用溶劑DMF溶解并定容，配制成濃度為1.0×10-3mol/L的探針儲(chǔ)備液待用。稱取適量金屬硝酸鹽或水合金屬硝酸鹽移入容量瓶中用蒸餾水定容，配制濃度為1.0×10-3mol/L金屬離子儲(chǔ)備液待用。在熒光發(fā)射光譜測(cè)試中，向石英比色皿中加入2 mL的MeOH∶H2O=1∶1(V∶V) 的混合溶液(pH=7.2)，接著用微量進(jìn)樣器加入20 μL的待用的探針儲(chǔ)備液(測(cè)定檢測(cè)限加入5 μL待用的探針儲(chǔ)備液)，最后加入待用的金屬離子儲(chǔ)備液，進(jìn)行光譜測(cè)試。其中熒光發(fā)射光譜的激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，狹縫均為10 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針對(duì)金屬離子的識(shí)別性能

研究了探針對(duì)常見(jiàn)金屬離子的識(shí)別能力，結(jié)果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)金屬離子加入后的熒光強(qiáng)度比較低，表明對(duì)探針沒(méi)有響應(yīng)或只有微弱的響應(yīng)。而當(dāng)加入Mg2+時(shí)，在498 nm處出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，測(cè)試溶液在365 nm紫外光下發(fā)出明亮的藍(lán)綠色熒光，結(jié)果顯示在圖2中。表明Mg2+對(duì)探針有積極的響應(yīng)，即探針對(duì)Mg2+有很好的選擇性。其原因主要是在加入Mg2+之前，探針?lè)肿又械腘原子上的孤對(duì)電子向香豆素基團(tuán)轉(zhuǎn)移電子，此時(shí)探針?lè)肿拥臒晒夥浅Ｎ⑷酰划?dāng)加入Mg2+之后，N原子上的孤對(duì)電子與Mg2+形成配位鍵，限制了孤對(duì)電子轉(zhuǎn)移，使得光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移受阻，從而造成探針出現(xiàn)很強(qiáng)的熒光發(fā)射。

圖2 不同金屬離子存在下探針(1.0×10-5mol/L)的熒光發(fā)射光譜

Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe(1.0×10-5mol/L)in the presence of different metal ions

3.2 探針對(duì)Mg2+的熒光發(fā)射光譜

在MeOH∶H2O=1∶1(V∶V)的混合溶液中，加入濃度為1.0×10-5mol/L探針溶液，然后逐漸滴加Mg2+溶液，觀察熒光發(fā)射光譜的熒光強(qiáng)度不再增加為止。如圖3所示，可以發(fā)現(xiàn)隨著Mg2+濃度的增加熒光發(fā)射光譜逐漸增強(qiáng)，其熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在498 nm 處。從起始到滴定終點(diǎn)的熒光強(qiáng)度增加了約7倍，變化十分顯著。在圖3的右上

圖3 探針(1.0×10-5mol/L)隨著Mg2+濃度增加的熒光發(fā)射光譜

Fig.3 Fluorescence emission spectra of probe(1.0×10-5mol/L)with the increase of concentration of Mg2+

角小插圖是滴定曲線圖，可見(jiàn)隨著Mg2+濃度的增加，曲線緩慢增加，當(dāng)Mg2+的加入量為1.0當(dāng)量時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。所以可以判斷探針與Mg2+是按1∶1進(jìn)行配位的。

3.3 共存金屬離子的影響

設(shè)F0為探針本身的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為不同金屬離子加入時(shí)的熒光強(qiáng)度。如圖4所示，可知在所有共存金屬離子中，Mg2+比其他金屬離子具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力，通常對(duì)Mg2+形成嚴(yán)重干擾的Ca2+在這里并沒(méi)有對(duì)Mg2+構(gòu)成影響。雖然Cd2+對(duì)熒光有一定的猝滅，但并不影響競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果。因此，探針在選擇性識(shí)別Mg2+的同時(shí)，并不受到其他共存離子的影響，具有很好的抗干擾能力。

3.4 可逆性實(shí)驗(yàn)

可逆性是具有實(shí)用價(jià)值的熒光探針應(yīng)具備的性質(zhì)。圖5(a)表示濃度為1.0×10-5mol/L的探針溶液的熒光強(qiáng)度；圖5(b)表示向濃度為1.0×10-5mol/L的探針溶液中加入1.0當(dāng)量的Mg2+溶液后的熒光強(qiáng)度；圖5(c)表示再向上述溶液中加入1.0當(dāng)量的EDTA后的熒光強(qiáng)度?？梢?jiàn)最初探針的熒光很微弱，當(dāng)加入Mg2+后，探針與Mg2+

圖5 探針識(shí)別Mg2+ 的可逆性實(shí)驗(yàn)

相互配位，從而發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)綠色熒光。接著再加入EDTA后溶液的強(qiáng)熒光重新恢復(fù)到微弱的狀態(tài)，這是由于具有更強(qiáng)配位能力的EDTA與Mg2+結(jié)合形成新的配合物，并釋放出探針，其變化過(guò)程見(jiàn)圖5的右上角示意圖。因此探針識(shí)別Mg2+的過(guò)程是可逆的。

3.5 探針與Mg2+的配位比的確定

采用熒光光譜法確定探針與Mg2+的配位比。具體在Job’s plot實(shí)驗(yàn)中，改變探針與Mg2+的濃度，但維持兩者的總濃度恒定，通過(guò)Job’s plot曲線分析配位比。結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的 [Mg2+]/([Mg2+]+[L] )的量比為0.5，這充分證明了探針與Mg2+的配位比為1∶1。這一結(jié)論與滴定曲線的結(jié)果是一致的。

圖6 探針與Mg2+的Job’s plot 曲線

3.6 檢測(cè)限的測(cè)定

檢測(cè)限反映了探針識(shí)別金屬離子的靈敏度，是考察探針優(yōu)劣的重要指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)中，先向石英比色皿中加入2 mL的MeOH∶H2O=1∶1(V∶V)溶液，再加入5 μL探針儲(chǔ)備液，然后每次加入0.4 μL的濃度為1.0×10-3mol/L的Mg2+儲(chǔ)備液，記錄下每次測(cè)試的熒光強(qiáng)度，并擬合曲線。如圖7

圖7 探針對(duì)Mg2+的檢測(cè)限

所示，擬合線性方程為y=69.5786x+ 59.4125，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 7。檢測(cè)限可由公式D=3σ/k得到，其中σ表示經(jīng)幾次測(cè)量的探針空白溶液的熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k則為擬合線性曲線的斜率。經(jīng)計(jì)算得出檢測(cè)限為7.3×10-8mol/L，即探針檢測(cè)到Mg2+的最低濃度為7.3×10-8mol/L。

3.7 反應(yīng)機(jī)理的探討

該探針以香豆素為熒光團(tuán)，探針?lè)肿又械碾s原子N、O參與了與Mg2+的配位作用，Job’s plot和熒光滴定實(shí)驗(yàn)證明了探針與Mg2+是按1∶1配位的。反應(yīng)機(jī)理如圖8所示，在未加入Mg2+之前，探針?lè)肿又蠸chiff堿的N原子上的孤對(duì)電子向香豆素基團(tuán)轉(zhuǎn)移電子，因而在激發(fā)態(tài)的探針?lè)肿又挥形⑷醯臒晒猓划?dāng)探針與Mg2+結(jié)合以后，由于N原子參與了配位作用，N原子上的孤對(duì)電子不再發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時(shí)激發(fā)態(tài)的探針?lè)肿优cMg2+配位后就會(huì)發(fā)出很強(qiáng)的熒光。

圖8 探針與Mg2+的反應(yīng)機(jī)理

4 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)合成了一種新型的基于Schiff堿結(jié)構(gòu)的香豆素類Mg2+熒光探針，該探針經(jīng)光譜實(shí)驗(yàn)表明在識(shí)別Mg2+的過(guò)程中，具有很好的離子選擇性和抗干擾性，探針與Mg2+是依據(jù)1∶1的比例配位而形成配合物的，探針檢測(cè)Mg2+的檢測(cè)限為7.3×10-8mol/L，因而具有良好的靈敏度。探針識(shí)別Mg2+的過(guò)程是具有可逆性的。反應(yīng)機(jī)理反映了探針與Mg2+配位后發(fā)出強(qiáng)熒光是由于N原子配位后不能夠向香豆素基團(tuán)轉(zhuǎn)移電子造成的。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明合成的新型Mg2+熒光探針性能良好，為生命科學(xué)等領(lǐng)域?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)Mg2+的情況提供了可靠的實(shí)驗(yàn)保證。