不同年齡自發(fā)性高血壓大鼠血漿和心室肌AngⅡ及心室肌ATR表達*

張軍波， 呂穎， 韓穩(wěn)琦， 劉仲偉， 潘軍強， 王軍奎

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院 周圍血管科， 陜西 西安 710061； 2.陜西省人民醫(yī)院&西安交通大學第三附屬醫(yī)院 心內科， 陜西 西安 710068)

流行病學研究表明，高血壓是一種年齡相關疾病，除引起血壓升高外，還會導致左心室重構等靶器官損害，高血壓與左心室肥厚(left ventricular hypertension，LVH)均是心血管疾病發(fā)病和死亡的主要危險因素[1]。在心血管系統(tǒng)，循環(huán)血液及局部組織中均存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)，有證據(jù)表明局部RAS較循環(huán)RAS對高血壓發(fā)生、發(fā)展及其靶器官損害有著更為重要的作用。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是血管局部RAS中最主要的效應活性肽，主要通過2個血管緊張素受體(angiotensin receptor，ATR)亞型【 Ⅰ型(angiotensin receptor-1，AT1)和Ⅱ型(angiotensin receptor-1，AT2)】發(fā)揮作用。AngⅡ與AT1結合后，主要發(fā)揮血管收縮和促醛固酮分泌的作用，還能刺激產(chǎn)生細胞因子，促進細胞增殖、促纖維化和促炎癥反應；AT2的作用與AT1相反，過度表達的AT2起著對抗AT1介導的生物效應，包括血管舒張、抑制增殖等[3]。ATR在線粒體、細胞核或細胞膜的相對表達，決定了局部RAS激活后的病理生理效應[4]。本研究通過探析不同年齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)心肌局部AT1、AT2及二者比例與心肌結構重塑的關系，從而為老年高血壓患者心肌肥厚的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑儀器

60只雄性SHR大鼠(第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)均分為幼年組(7周齡)、成年組(26周齡)及老年組(51周齡)，每組各20只。AT1及AT2一抗由美國ADI4生物制劑公司生產(chǎn)，SA1022即用型兔二抗SABC免疫純化試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純級。儀器RBP-I 型大鼠血壓心率測定儀由中日友好醫(yī)院臨床研究所生產(chǎn)，QWin550CW圖像系統(tǒng)由德國萊卡公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1循環(huán)血漿中AngⅡ濃度測定 所有大鼠自由飲水，每12 h光暗循環(huán)1次，溫度18～25 ℃，濕度45%～65%，氨濃度<20 mg/L，換氣量為1.27 m/h。各組SHR大鼠預適應飼養(yǎng)1周，稱取體質量(Body Mass，BM)，苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后從腹主動脈抽取血液4～5 mL至試管中，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min后取上層血漿，-70 ℃冰箱保存；取0.5 g心肌低溫勻漿后，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min；ELISA法測以上樣品中AngII含量，雙孔法取平均值。

1.2.2心室肌標本的取材及膠原纖維和ATR的檢測 4%多聚甲醛灌注取材，取左心室固定24 h，石蠟包埋切片，Mallory染色觀察膠原纖維，免疫組化SABC法(一抗1∶50，二抗1∶200)測定AT1和AT2表達。采用QWin550CW圖像系統(tǒng)進行采集與分析，測Mallory染色下藍色膠原纖維的累積光密度值(integral optical density，IOD)。對于免疫組化SABC法染色，測定的ATR蛋白表達水平以每個視野的陽性物質的灰度值(gray density，GD)表示，在高倍鏡下選3個視野，測定每個視野的陽性物質的GD。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血漿及心室肌局部AngⅡ

3組SHR大鼠循環(huán)血漿AngⅡ含量隨年齡增加而升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，心室肌勻漿AngⅡ含量隨年齡增加而升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組SHR大鼠血漿及心室肌組織AngⅡ的表達Tab.1 Plasma and the myocardial tissue AngⅡ expression of three groups SHR

(1)與幼年組比較，P<0.01；(2)與成年組比較，P<0.01

2.2 心肌纖維化

3組SHR大鼠心肌IOD(IOD的大小與纖維化程度正相關)隨年齡增加而增加，老年組(348±27)>成年組(163±18)>幼年組(90±20)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；且心肌膠原纖維沉積隨年齡增加而明顯增加，尤其在老年組；見圖1。老年組Mallory染色可見心肌組織間冠狀動脈中膜增厚、纖維化，管腔變小，見圖2。

幼年組 成年組 老年組注：紅色為心肌細胞，藍色為膠原纖維沉積圖1 各組SHR大鼠心室肌組織形態(tài)學結果(Mallory染色，×100)Fig.1 Myocardial Histology of three SHR groups

圖2 老年組SHR心肌內冠狀動脈重構(Mallory染色，×100)Fig.2 Myocardial coronary remodeling in the elderly group

2.3 心肌ATR表達

免疫組化及蘇木素復染圖片中，圖像顏色越深，代表蛋白表達量越高，而GD值也越小。結果提示AT1及AT2在各年齡組的表達有差異：左室心肌中AT1的GD值隨年齡增加而降低，GD值在幼年組均高于成年及老年組(P<0.05，或<0.01)，成年組高于老年組(P<0.05)，AT2的GD隨年齡的增加而增加，幼年組均低于成年及老年組(P<0.05)，成年組與老年組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；老年組和成年組的AT1/AT2值均低于幼年組(P<0.01)，但成年組大鼠與老年組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2和圖3。

表2 各組SHR心肌ATR表達Tab.2 Comparison of IOD value of Mallory staining in three SHR groups

與幼年組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01；(3)與成年組比較，P<0.05

注：A、D為幼年組， B、 E為成年組， C 、F為老年組；A、B、C為AT1，D、E、F為AT2，圖象顏色深度越淺，表示蛋白的表達越少圖3 各組SHR大鼠心室肌細胞AT1及AT2表達(蘇木素染色，×100) Fig.3 Expression of AT1 and AT2 in cardiomyocytes in all groups

3 討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高鹽負荷能顯著增加心肌、主動脈及腸系膜上動脈壁局部AT1和AT2表達，在血管中以中等直徑的腸系膜上動脈壁改變較為顯著[5-6]，血管局部的AT1和AT2也隨著年齡增加有一定的改變[7]。本研究發(fā)現(xiàn)老年組SHR大鼠心室肌纖維化增加，血漿AngⅡ含量隨年齡增高無明顯變化，心肌勻漿中AngⅡ含量隨年齡增加而升高，提示局部RAS表達改變對于心肌纖維化的作用可能較循環(huán)RAS更為重要。

30 d和100 d Ren-2轉基因大鼠腹腔注射抗AT1藥物，除降壓作用外，還可減少心肌肥厚，大幅度改善血管緊張素依賴性血管收縮[8]。線粒體對所有組織代謝和細胞凋亡起到關鍵作用，特別是在老齡化過程中，已有報道在腎皮質、心肌細胞的線粒體中存在AT1，幼齡動物線粒體AT1水平很低，隨著年齡增長其在核及線粒體表達顯著增加[9]。

AT2在大鼠心肌細胞線粒體膜高表達[10]，并在胚胎期高表達，出生后迅速下降；在高血壓等病理狀態(tài)下，成年大鼠局部心肌AT2的增高可能繼發(fā)于AT1的增高，發(fā)揮一定的代償作用。相較AT1，線粒體中AT2表達隨年齡增長逐步降低。與本研究相似，Gwathmey等[9]發(fā)現(xiàn)年輕大鼠腎細胞中AT2占ATR的80%，隨著年齡的增加，AT1占85%，線粒體中AT2隨年齡增加而減少，長期服用血管緊張素受體拮抗劑后可以在體內恢復二者平衡，增加線粒體AT2表達。

心臟中成纖維細胞約占到心肌結構的2/3，心肌的細胞外基質主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，尤其是前者占心肌間質總膠原比重超過80%。心肌纖維化是心臟老化的一個重要特征，心肌間質纖維化會引發(fā)心肌結構紊亂、僵硬度增加、心臟順應性降低、心律失常發(fā)生率增高，是心肌異常僵硬的結構基礎[11]。一些臨床研究已證實，高血壓患者除心肌重構外，心肌內小的冠狀動脈也發(fā)生了結構重構，中膜厚度/管腔比率增大和纖維化[12]。纖維化亦是高血壓患者冠脈血管舒張能力受到損害的主要因素。

因GD值與心肌細胞圖象顏色深度呈反相關，因此本研究中AT1表達隨年齡增加而升高，AT2表達隨年齡增加而降低，導致AT1/AT2比值持續(xù)變小，同時心肌膠原纖維沉積明顯增加，尤其是老年組。中年組與老年組AT2無進一步減少，甚至有增加的趨勢，可能與血壓和局部AngⅡ增加將上調AT2的表達有關[13]。此外，一系列體外實驗顯示，局部RAS對心肌存在獨立于血壓外的重構作用，組織纖維化發(fā)生可不依賴于血壓升高[14]。成纖維細胞的激活與增生是導致年齡增長過程中轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)過度表達和膠原沉積的原因[15]，AngⅡ和TGF-β1增加抑制了基質金屬蛋白酶活性，刺激蛋白酶抑制劑的表達，導致膠原纖維的降解減少，促使心肌纖維化[11]。

綜上所述，本研究結果顯示心肌局部AT1、AT2及二者比例的改變可能是由于年齡增長導致心肌重塑、膠原沉積的機制之一，提示防治高血壓年齡增加過程中的心肌纖維化對維持正常心臟結構具有重要的意義。