苗藥驗(yàn)方“四大血”對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠IL-17和VEGF表達(dá)的影響*

袁桃花， 李欣芯， 陳麗亞， 曹勝宇， 孫見飛， 劉華， 吳昌學(xué)， 吳寧*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種侵犯滑膜關(guān)節(jié)的慢性、炎癥性自身免疫系統(tǒng)疾病[1]，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫、畸形等，致殘率在所有關(guān)節(jié)病中高居首位[2-3]。目前，臨床上沒有特異且有效的治療RA藥物[4-5]。苗藥驗(yàn)方“四大血”(sidaxue，SX)由苗藥黑骨藤、見血飛、五花血藤、雞血藤4味藤本藥材組成，是苗族地區(qū)治療氣血瘀阻等疾病的天然藥方，也是其作為治療RA的特有藥方，但至今僅為經(jīng)驗(yàn)用藥階段，關(guān)于其治療RA的作用機(jī)制研究較少[6]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，SX對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠有良好的療效，能緩解關(guān)節(jié)腫脹程度、抑制關(guān)節(jié)滑膜組織增生等病理表現(xiàn)[7-8]。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠(collagen induced arthritis in rats，CIA)關(guān)節(jié)局部的炎癥等病理表現(xiàn)與RA相似，是研究RA的常用模型[9-10]，本研究通過復(fù)制CIA大鼠動(dòng)物模型，采用不同劑量的SX對(duì)其治療，觀察SX治療前后CIA大鼠關(guān)節(jié)足腫脹度(ER)、病理組織變化， 分析SX對(duì)CIA大鼠白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量的影響，評(píng)估SX對(duì)RA的治療效果、探討其作用機(jī)制，為臨床開發(fā)SX提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物 42只SD(Sprague Dawley)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由Chongqing Tengxin Biological Technology Co. Ltd提供，合格證號(hào)[SCXK(渝)2007．005]；苗藥SX由貴州中醫(yī)藥大學(xué)苗醫(yī)藥教研室提供并經(jīng)田振華副教授鑒定，雷公藤多苷片購自HUANGSHI FEIYUN CO.LTD，20080301；Freund’S Complete Adjuvent(IFA)購自美國Sigma公司，批號(hào)033K8933。

1.1.2主要試劑 大鼠IL-17 ELISA試劑盒購于Shenzhen zike Biological Technology，大鼠VEGF試劑盒購于安徽巧伊生物技術(shù)有限公司，Prime ScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自TaKaRa Biomedical Technology (Beijing)，AceQ qpCR SYBR Green Master Mix購自Vazyme Biotech Co,Ltd，多功能酶標(biāo)儀為美國，熒光定量pCR儀為Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1分組 42只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(NG組，n=7)和造模組(n=35)，造模組大鼠用牛Ⅱ型膠原適量與等量不完全弗氏佐劑混合乳化劑于尾根部皮下注射復(fù)制CIA動(dòng)物模型，造模第14天時(shí)將造模組大鼠分為5組，即模型對(duì)照組(Mod組，n=7)，SX 高、中、低藥物治療組( 40、20、10 g/kg組，n=7)以及陽性藥物對(duì)照組(雷公藤多甙片，GTW組，n=7)。

1.2.2構(gòu)建CIA動(dòng)物模型 將4 g/L牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑在冰上充分混勻乳化后，滴一滴于水中不擴(kuò)散，取乳劑200 μL于大鼠尾根及左足墊部皮下注射，NG組用等量生理鹽水(physiological saline，NS)注射，一周后加強(qiáng)免疫，總計(jì)300 μL；造模第14天時(shí)，通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評(píng)分判定造模情況[11]。AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)無紅腫為0分，關(guān)節(jié)有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹為1分，關(guān)節(jié)病變并有中度紅腫為2分，關(guān)節(jié)除中度紅腫外并伴有輕度功能障礙為3分，關(guān)節(jié)重度紅腫、僵直甚至畸形并伴嚴(yán)重功能障礙為4分；AI評(píng)分≥2分為造模成功。

1.2.3SX制備 給藥單味苗藥五花血藤、雞血藤、見血飛、黑骨藤按照15∶22∶15∶8的比例配制，共取2 000 g，參考文獻(xiàn)[6-8]煎制成濃度為4 kg/L的試藥(按生藥量計(jì))，置于4 ℃冰箱備用。給藥方案：造模成功后，藥物治療組大鼠按0.1 L/kg劑量給予SX進(jìn)行灌胃治療，SX 40 g/kg、20 g/kg、10 g/kg組濃度依次為4 g/mL、2 g/mL及1 g/mL，GTW組按4 g/mL進(jìn)行灌胃，NG組和Mod組用等量NS灌胃，灌胃給藥21 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1足趾ER測(cè)量 造模前及造模第7、14天，給藥第7、14及21天時(shí)，采用自制足腫儀測(cè)量大鼠左右后足跖容積，反復(fù)3次取均值，計(jì)算足趾ER，公式為ER(%)=(V1-V2)/V2×100%(其中V2為造模前的容積，V1造模后的容積)。

1.3.2標(biāo)本采集及大鼠血清IL-17、VEGF的含量 給藥第21天，最后一次SX灌胃結(jié)束時(shí)，用10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血，常溫下垂直靜置2 h，見淡黃色血清析出后，3 000 r /min離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定大鼠血清IL-17、VEGF含量，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行；同時(shí)取出大鼠滑膜組織，部分制作病理組織切片，觀察其炎癥反應(yīng)，部分用于檢測(cè)VEGFmRNA表達(dá)。

1.3.3大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的炎癥反應(yīng)及VEGFmRNA表達(dá) 取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織制作的病理組織切片，4%中性甲醛固定液中進(jìn)行固定，觀察其炎癥反應(yīng)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGFmRNA表達(dá)水平，根據(jù)GenBank提供的大鼠VEGFmRNA序列(AY702972)、GApDHmRNA序列(內(nèi)對(duì)照，NM_017008)；進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成，VEGF上游引物為5′ CCTGGCTTTACTGCTGTACCT 3′，下游引物為5′ GCTGGTAGACGTCCATGAACT 3′；GApDH上游引物為5′ GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC 3′，下游引物為5′ GGTTCACACCCATCACAAACATG 3′；提取樣本總RNA，溶于DEPC水中(-80 ℃保存?zhèn)溆?，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA樣品A260/280值及濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣本，采用pCR操作擴(kuò)增目的基因，條件為95 ℃預(yù)變性 5 min， 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s循環(huán)40次，溶解曲線擴(kuò)增條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，用2^-△△CT法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠足趾外觀變化

在造模第7天時(shí)，NG組大鼠生理狀態(tài)正常、毛色光滑，體重增加。而Mod組部分大鼠注射乳化劑的關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微紅腫，活躍程度降低，毛色光澤下降；造模第14天時(shí)，Mod組大鼠致炎關(guān)節(jié)基本都出現(xiàn)不同程度的紅腫，甚至無法直立行走，活動(dòng)程度整體降低，毛色缺乏光澤。藥物治療第7天時(shí)，與NG組比較，SX 40 g/kg、20 g/kg組、GTW組大鼠活動(dòng)程度稍微變大，部分大鼠關(guān)節(jié)紅腫開始減退；治療第14天時(shí)，除SX 10 g/kg組外，各治療組大鼠關(guān)節(jié)紅腫情況都開始得到緩解；治療第21天時(shí)，SX 10 g/kg組小部分大鼠關(guān)節(jié)有輕度紅腫，但均能正常行走，其余各治療組大鼠關(guān)節(jié)紅腫消退，大鼠狀態(tài)良好。見圖1。

注：A、B、C、D、E及F依次為NG、Mod、GTW、SX 40 g/kg、SX 20 g/kg及SX 10 g/kg組圖1 各組大鼠藥物治療第21天時(shí)足趾外觀Fig.1 Joint swelling degree of rats in each group after 21th day of drug treatment

2.2 大鼠后足趾關(guān)節(jié)ER

造模第14天時(shí)，除NG組外，其余各組大鼠左右后足趾均表現(xiàn)紅腫，經(jīng)過SX及GTW治療后，灌胃給藥第7天時(shí)，與Mod組比較，各組大鼠后足趾ER均不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥物治療第14、21天時(shí)，SX和GTW治療組與Mod組比較，后足趾ER均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

分組造模第14天給藥第7天第14天第21天NG組0.14±0.030.12±0.050.11±0.010.15±0.04Mod組0.57±0.07(1)0.85±0.22(1)0.82±0.24(1)0.88±0.23(1)GTW組0.43±0.08(1)0.37±0.16(1)(3)0.29±0.04(1)(3)0.20±0.06(1)(3)40 g/kg組0.42±0.09(1)0.35±0.16(1)(2)0.27±0.07(1)(3)0.15±0.01(1)(3)20 g/kg組0.50±0.02(1)0.39±0.20(1)0.30±0.14(1)(3)0.17±0.15(1)(3)10 g/kg組0.54±0.11(1)0.41±0.11(1)0.39±0.12(1)(3)0.19±0.07(1)(3)

(1)與NG組比較，P<0.01；與Mod組比較，(2)P<0.05，(3)P<0.01

2.3 血清IL-17及VEGF含量

給藥第21天時(shí)，與NG組比較，Mod組血清IL-17、VEGF含量升高(P<0.05)；與Mod組比較，NG、SX 40 g/kg組血清IL-17含量下降(P<0.05)，SX 20 g/kg、GTW組血清IL-17含量下降更明顯(P<0.01)；與Mod組比較，SX 40、20、10 g/kg組及GTW組血清中VEGF含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-17及VEGF含量Tab.2 Serum IL-17, VEGF content in each group of CIA rats

與NG組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01；與Mod組比較，(3)P<0.05，(4)P<0.01

2.4 大鼠滑膜組織HE染色

從圖2中可以看出，NG組大鼠滑膜組織由1～2層滑膜細(xì)胞構(gòu)成，分布緊密、整齊，無炎癥細(xì)胞的浸潤及血管增生；Mod組大鼠滑膜組織排列紊亂、增生明顯，多達(dá)5～6層排列，且組織水腫嚴(yán)重，周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤、血管增生現(xiàn)象，在軟骨面，還可見部分軟骨細(xì)胞增生。SX 10 g/kg組較Mod組的滑膜組織水腫程度較Mod組有所改善，增生及炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象均減少；而SX 40 、20 g/kg組及GTW組僅可見少量的炎性細(xì)胞浸潤及新生組織血管，增生較少，沒有明顯的軟骨及骨組織的破壞，提示滑膜組織病理狀況明顯改善。

2.5 SX對(duì)CIA大鼠滑膜關(guān)節(jié)組織VEGF mRNA表達(dá)的影響

給藥第21天時(shí)，與NG組相比，Mod組VEGFmRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與Mod組比較，SX 40 g/kg、10 g/kg組VEGFmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；SX各組與GTW組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 VEGF mRNA在大鼠滑膜組織中的表達(dá)Tab.3 Expression of VEGF mRNA in synovial tissue of CIA rats

(1)與NG組比較，P<0.05，(2)與Mod組比較，P<0.05

3 討論

RA作為一種系統(tǒng)性的慢性自身免疫疾病，在全球均有發(fā)病，在我國，其患病率為0.32%～0.36%，是造成人類喪失勞動(dòng)力和致殘的主要原因之一[1-3]，其病變可以累及全身不同臟器(如肺、心、腎、神經(jīng)及消化系統(tǒng)等)[12]，但尤以關(guān)節(jié)受累最為突出，其病理表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)局部紅腫，嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形，病理變化為增生性滑膜炎，關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤[13]。目前，臨床上沒有治療RA的特效藥物，且常用的藥物如改善關(guān)節(jié)炎癥狀的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、改變病情抗風(fēng)濕藥(disease modifying anti-rheumatic drug，DMARDs)等均具有一定的毒副作用[14]。RA作為難治性疾病之一，目前無法根治，國內(nèi)外學(xué)者為了更好地對(duì)RA開展研究，根據(jù)RA的病因病機(jī)、病理學(xué)、免疫學(xué)特點(diǎn)等進(jìn)行了大量的動(dòng)物試驗(yàn)，形成了一些較為成熟的AA、CIA模型動(dòng)物模型，二者在臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和病理機(jī)制上與人RA有著相似的特點(diǎn)，是常用的兩種RA模型，其中CIA模型較為穩(wěn)定，是研究RA發(fā)病機(jī)制和篩選治療RA藥物的理想模型，也是目前國際上公認(rèn)的關(guān)節(jié)炎模型[9-10]。而RA作為一種慢性免疫性炎癥疾病，目前發(fā)病機(jī)理尚不清楚，而機(jī)體炎癥反應(yīng)與多種促炎細(xì)胞因子密切相關(guān)，在RA中白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在RA滑膜的病變過程中起重要作用，其中IL-17 已被證實(shí)在組織炎癥、自身免疫和宿主防御機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是一種較強(qiáng)的炎性細(xì)胞因子，RA患者關(guān)節(jié)滑液中出現(xiàn)高水平IL-17[15-17]。目前許多研究證實(shí)炎癥因子(如TNF-α、IL-1β)的異常表達(dá)是RA發(fā)病及血管形成的重要原因，近年來，人們發(fā)現(xiàn)在RA的滑膜病變過程中有豐富的血管形成因子的表達(dá)，其中VEGF是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，是促血管生成的主要因素之一，是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，其能增加 RA微血管通透性，促使RA血管新生，加重血管翳癥狀[18-20]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，SX能減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度，較好的改善CIA模型大鼠關(guān)節(jié)組織病理狀況，且SX 40 g/kg改善明顯，SX能下調(diào)血清中IL-17及VEGF的表達(dá)，且下調(diào)VEGF的水平比IL-17的稍高，初步說明在CIA大鼠的病理表現(xiàn)中，SX下調(diào)血管因子VEGF的作用比炎癥因子IL-17的作用稍強(qiáng)。同時(shí)，本研究還檢測(cè)出SX 10 g/kg對(duì)CIA大鼠血清IL-17的影響較小，而對(duì)于VEGF則是SX 40 g/kg影響相對(duì)較小，說明RA血管翳程度與炎癥反應(yīng)在一定程度上不呈正向發(fā)展關(guān)系。

注：A、B、C、D、E及F依次為NG、Mod、GTW、SX 40 g/kg、SX 20 g/kg及SX 10 g/kg組圖2 各組大鼠滑膜組織HE染色結(jié)果(400×) Fig.2 Pathological tissue section of each group

綜上所述，SX能通過調(diào)節(jié)IL-17、VEGF含量的變化對(duì)CIA大鼠病情的改善起到積極的作用，這為下一步深入研究SX通過調(diào)控VEGF及IL-17發(fā)揮對(duì)RA治療的具體作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。