一份特有紅花甜蕎活性物質(zhì)的抗氧化特性研究

侯澤豪，孫坤坤，魏淑東，王書平，張迎新，尹軍良，劉志雄，方正武

(1. 長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025；2. 長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；3 長江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434025)

蕎麥，屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬，是一種重要的雜糧作物，分為甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtaraicumGaerth)2個栽培品種，甜蕎為異花授粉作物，結(jié)實率較低，在亞洲、歐洲和美洲均有大量種植[1]，而苦蕎為自花授粉作物，主要栽培于中國，在多數(shù)西方國家被認(rèn)為是野生植物[2]。蕎麥中富含多種藥用和營養(yǎng)保健成分，如膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)和多酚類物質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)，具有降血壓、抗氧化和降低毛細(xì)管脆性等多種藥理作用，是重要的藥食兩用作物[3]。研究表明多酚類物質(zhì)是食物具有抗氧化能力和抑制慢性疾病的主要原因之一[4]，而目前常使用化學(xué)抗氧化性的方法(如DPPH法、FRAP法、ORAC法和ABTS法)研究多酚類物質(zhì)的抗氧化能力[4-6]。如Min等[7]利用DPPH法和ORAC法來評價具有不同麩皮顏色的大米的抗氧化能力，研究結(jié)果表明多酚物質(zhì)的含量與抗氧化能力具有高度正相關(guān)。蕎麥因具有豐富的多酚類物質(zhì)，因此，在食品工業(yè)上，蕎麥的籽粒、葉片和花可制成蕎麥茶或保健產(chǎn)品等，并起到降低血液中的膽固醇和葡萄糖水平的作用[8]。

作物植株顏色是一種重要的經(jīng)濟性狀，鮮艷的顏色不僅能改善產(chǎn)品的色澤，而且能激發(fā)消費者的購買欲和食欲。花青素作為植物呈色中的一類重要色素，可使植物呈現(xiàn)粉紅色到藍(lán)紫色[9-10]，同時也是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的天然水溶性自由基清除劑[11]。由于花青素的抗氧化能力及其在預(yù)防人類慢性疾病、控制肥胖和減輕糖尿病中的重要作用，因此，色彩鮮艷的天然食物受到國內(nèi)外消費者的廣泛推崇[12-13]。

Suzuki等[14]通過反相液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對紅花蕎麥品種‘Gan-Chao’花瓣中的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和種類進行分析，結(jié)果表明紅花蕎麥花瓣中花青素種類以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷為主，而白花蕎麥花瓣中并未檢測到花青素的存在；Kim等[15]的研究發(fā)現(xiàn)‘Gan-Chao’花瓣中的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)0.19 mg/g，但其葉片中僅含有微量的花青素。長江大學(xué)小麥與蕎麥種質(zhì)創(chuàng)新課題組(以下稱本課題組)在前期的研究中，從中國貴州畢節(jié)地區(qū)收集到一份甜蕎農(nóng)家品種(命名為‘HHTQ’)[16]，其子葉、葉片、葉柄和花序在田間生長發(fā)育時均表現(xiàn)為深紅色(圖1-A)，是一份特有的農(nóng)家紅花蕎麥品種。

為了明確‘HHTQ’中活性物質(zhì)的分布和抗氧化特性，本試驗采用高效液相色譜法對該材料的子葉、葉片、葉柄及花序的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行測定，同時利用分光光度法測定其總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并分析FRAP抗氧化能力，DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力，為進一步開發(fā)利用‘HHTQ’蕎麥資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紅花甜蕎品種是本課題組于2009年從貴州畢節(jié)地區(qū)(105°36′E，26°21′N)征集所得，經(jīng) 8 a選育，現(xiàn)命名為‘HHTQ’，并于長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗基地(112°15′E，30°36′N)進行繁育。于2018年9月播種，待種子發(fā)芽出土，子葉完成展開后，對生長健壯且無病蟲害的植株進行子葉取樣；待植株生長50 d左右至盛花期，對葉柄、葉片和花序進行取樣，各樣品利用真空冷凍干燥機冷凍干燥后研磨成凍干粉，-20 ℃保存，備用。

1.2 儀器與試劑

UV-8000型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；Agilent1260高效液相色譜儀—Agilent 1260 series VWD 檢測器(美國Agilent 公司)；EYELA N-1200B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；真空冷凍干燥機(上海博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；5810R 高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)、沒食子酸(Gallic acid)、蘆丁(Rutin)、Folin酚試劑均購自美國Sigma公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷購自北京索萊寶科技有限公司；色譜純甲醇、甲酸均購自上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 花青素的提取及高效液相色譜分析 花青素的提取參考Chu等[17]的方法略加改動，準(zhǔn)確稱取100 mg凍干樣品，置于15 mL 離心管中，加入5 mL含φ=1% HCl的甲醇提取液，于4 ℃下避光震蕩24 h。樣品經(jīng)4 ℃，4 500 g離心10 min后，取500 μL上清液于新的1.5 mL離心管中，加入500 μL去離子和300 μL氯仿，充分混勻去除葉綠素，4 ℃ 13 500 g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液于新的1.5 mL離心管中，經(jīng)0.22 μm濾膜(索來寶，北京)過濾后，-20 ℃保存，備用，每個樣品做3個生物學(xué)重復(fù)。

采用Agilent1260高效液相色譜儀對花青素提取液進行定量分析。色譜條件為：色譜柱Inertsil ODS-3(250 mm × 4.6 mm，5 μm)C18色譜柱(島津，日本)，進樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長520 nm，柱溫25 ℃，流動相甲醇(A)-5%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫0～2 min，10% A；2～6 min，10%～20% A；6～10 min，20%～30% A；10～15 min，30%～35% A；15～20 min，35%～50% A；20～24 min，50%～90% A；24～29 min，90%～10% A；29～30 min，10% A。以標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(y= 21.513x-2.143 1，R2=0.998 8，測定范圍：5～50 μg/mL)和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷(y= 34.401x- 29.958，R2=0.998 3，測定范圍：5～75 μg/mL)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量測定，其中y為峰面積，x為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(μg/mL)，最終結(jié)果以每1 g樣品干質(zhì)量中所含花青素(mg/g)表示。

1.3.2 蕎麥各組織游離酚物質(zhì)的提取 參照Min等[7]的方法并稍有改進，準(zhǔn)確稱取100 mg樣品凍干粉，置于10 mL離心管中，加入8 mL正己烷，上下顛倒混勻后靜置10 min，4 ℃，4 500 g離心10 min，棄上清，重復(fù)3次。向沉淀中加入8 mL含φ=1% HCl的甲醇提取液，每10 min上下顛倒1次，30 min后4 ℃ 4 500 g離心10 min，收集上清液，重復(fù)3次，合并上清液，37 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用含φ=1% HCl的甲醇提取液復(fù)溶并定容至15 mL，每個樣品做3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 采用Folin酚法[18]測定樣品中的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)以干基每1 g樣品干質(zhì)量中所含沒食子酸量(mg/g)表示；采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[19]測定總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)以干基每1 g樣品中所含蘆丁量(mg/g)表示。

1.3.4 FRAP抗氧化能力、DPPH·和 ABTS+·清除能力測定 參考Benzie 和 Strain的方法[20]測定游離酚提取液的FRAP抗氧化能力，以奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.005 3x-0.080 7 (R2=0.998 3)，其中y為吸光度，x為Trolox質(zhì)量濃度(μg/mL)。結(jié)果以干基每1 g樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)表示。

參考Chen和Ho的方法[21]測定游離酚提取液的DPPH·清除能力，以Trolox當(dāng)量為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y= -0.002 7x+ 0.512 9(R2=0.995 1)，其中y為吸光度，x為Trolox質(zhì)量濃度(μg/mL)。結(jié)果以干基每1 g樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)表示。

參考Re等[22]的方法測定游離酚提取液的ABTS+·清除能力，以Trolox當(dāng)量為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=-0.00 3x+ 0.800 8(R2= 0.997 4)，其中y為吸光度，x為Trolox質(zhì)量濃度(μg/mL)。結(jié)果以干基每1 g樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)表示。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計

利用Excel 2013和SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(Means ± SD)表示，采用單因素方差分析，不同組織間比較采用Duncan’s法，顯著水平為0.05，利用Origin 2017進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花甜蕎‘HHTQ’的表型性狀

由圖1-A可以看出，‘HHTQ’蕎麥材料表現(xiàn)出鮮艷的色彩，其葉片邊緣、葉脈以及葉柄呈紫紅色。同時在整個花期，其花序均呈現(xiàn)出鮮艷的紅色，可能富含花青素，具有一定的觀賞價值和潛在應(yīng)用價值。

2.2 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

利用HPLC對紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位花青素提取液進行定量測定(圖1-B和表1)，發(fā)現(xiàn)4個部位的花青素積累差異較大。花序和葉柄中積累的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，顯著高于葉片和子葉(P<0.05)?；ㄐ蚝腿~柄積累的花青素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著差異，分別為3.43 mg/g和3.28 mg/g，但具有不同的花青素單體積累模式，花序中以積累矢車菊素-3-O-蕓香糖苷為主，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)2.90 mg/g，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的84.55%；而葉柄中則積累大量的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 3.02 mg/g，占花青素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 92.07%。子葉的花青素積累模式與葉柄相似，以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為主(0.96 mg/g，占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 72.73%)，而葉片則表現(xiàn)為等量積累。

A.紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位的表型性狀 Phenotypes of the four plant parts of the red-flowers buckwheat variety of ‘HHTQ’； B.花序、葉柄、葉片和子葉花青素提取液的高效液相色譜分析 HPLC profiles of anthocyanins extracted from the cotyledons, blades, petioles and inflorescences of the red-flowers buckwheat variety of‘HHTQ’

圖1 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位的花青素成分分析Fig.1 Anthocyanin composition analysis of different parts of red-flowers buckwheat variety ‘HHTQ’

注：同列中不同小寫字母表示組織間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。

Note:In the same columns,the different lowcase letters means significant difference (P<0.05)，the same below.

2.3 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表2可知，紅花甜蕎‘HHTQ’總酚和總黃酮在4個不同部位中的積累量存在顯著差異(P<0.05)，且總酚和總黃酮的積累模式在4個部位具有一致性，以花序中最高(總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為225.47 mg/g，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為128.96 mg/g)，葉柄中最低(總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.59 mg/g，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.28 mg/g)。4個部位的總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小順序均為：花序>葉片>子葉>葉柄。

2.4 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位抗氧化能力

‘HHTQ’蕎麥4個不同部位的抗氧化能力如圖2所示。4個不同部位的DPPH·清除能力的變幅為47.52～174.51 mg/g。各部位的 DPPH·清除能力差異較大，以花序的清除能力最強，為174.51 mg/g；其清除能力大小順序為：花序>葉片>子葉>葉柄。FRAP抗氧化能力與DPPH·清除能力趨勢一致，以花序最高，為 152.55 mg/g；葉片次之，為37.56 mg/g；以葉柄最低，為17.16 mg/g。在ABTS+·清除能力方面，花序的抗氧化能力顯著高于其他部位(P< 0.05)，為112.31 mg/g；葉柄，葉片和子葉的ABTS+·清除能力無差異，ABTS+·清除能力變幅為 8.63～12.05 mg/g。

表2 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Total phenols and total flavonoids in different parts of red-flower buckwheat variety of ‘HHTQ’ mg/g

不同字母表示差異顯著(P<0.05) Different letters mean significantly differences(P<0.05).

圖2 紅花甜蕎‘HHTQ’不同部位抗氧化能力
Fig.2 Antioxidant abilities of different parts of red-flower buckwheat variety of ‘HHTQ’

2.5 紅花甜蕎‘HHTQ’多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力的相關(guān)性分析

總酚、總黃酮和總花青素與抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)如表3所示。總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與DPPH·清除能力、FRAP抗氧化能力以及ABTS+·清除能力的相關(guān)性較大，相關(guān)系數(shù)在0.980以上。與總酚與總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比，總花青素與3個抗氧化能力指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)較低，分別為0.594(DPPH·清除能力)、0.530(FRAP抗氧化能力)和0.601(ABTS+·清除能力)。這些結(jié)果表明花青素作為一類酚類化合物，在植物抗氧化能力上發(fā)揮了一定的作用。

表3 總酚、總黃酮和總花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients of total phenols, total flavonoids and total anthocyanins with the antioxidant capacities

3 討 論

3.1 蕎麥中花青素的積累

前人的研究發(fā)現(xiàn)紅花甜蕎‘Gan-Chao’花瓣中的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨發(fā)育時期的變化而增加[14-15]，最高可達(dá)0.19 mg/g，但其葉片中僅含有微量的花青素[15]。本研究利用HPLC對紅花甜蕎‘HHTQ’的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行測定，發(fā)現(xiàn)該甜蕎品種在子葉、葉片、葉柄和花序中均積累了大量的花青素，花序中積累的花青素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3.43 mg/g，子葉和葉片中的花青素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到1.32 mg/g和1.44 mg/g，顯著高于‘Gan-Chao’。Kim等[15]利用熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因(如FePAL、FeCHS、FeDFR和FeANS等)在紅花蕎麥‘Gan-Chao’中表現(xiàn)出較高的表達(dá)量。周天山等[23]的研究發(fā)現(xiàn)紫芽茶樹中富含花青素，與綠芽茶樹相比，紫色芽葉片的花青素相關(guān)基因(如CsDFR、CsANS和 CsF3′H等)呈上調(diào)趨勢，而本課題在前期對紅花品種‘HHTQ’的轉(zhuǎn)錄組測序分析中同樣發(fā)現(xiàn)，‘HHTQ’的子葉和花序中與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因(如FeCHS、 FeF3′H和FeDFR)表現(xiàn)出較高的表達(dá)量[16]，但其內(nèi)在分子機理仍待研究，進一步探索花青素的積累機制對于培育和應(yīng)用富含花青素的蕎麥品種具有潛在價值。

3.2 蕎麥中的總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

多酚是廣泛存在于植物組織中的一類具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物[24]，黃酮類物質(zhì)(如蘆丁、表兒茶素等)是蕎麥多酚類物質(zhì)的重要組成成分[25]，因具有抗癌和抗氧化等多種作用而被廣泛應(yīng)用于抗癌以及預(yù)防冠心病等心腦疾病的藥物當(dāng)中[26]。由于蕎麥中富含多種維生素，必需氨基酸和多酚等功能活性物質(zhì)，因此蕎麥作為一種營養(yǎng)保健的粗糧而深受喜愛[27]。本次研究對蕎麥不同部位的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行測定，發(fā)現(xiàn)4個不同部位的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異(P<0.05)，以花序中的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為225.47 mg/g，且其總黃酮積累模式與總酚一致，以花序最高，為128.96 mg/g?？偡雍涂傸S酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低順序均為：花序>葉片>子葉>葉柄。這一研究結(jié)果與Zielinska等[28]的研究發(fā)現(xiàn)蕎麥不同部位的總黃酮化合物積累量差異較大(花朵>葉片>莖)的結(jié)果相似。

3.3 蕎麥多酚類物質(zhì)的抗氧化能力

前人的研究結(jié)果表明，蕎麥籽粒的抗氧化能力與總黃酮/蘆丁的含量成正相關(guān)，黃酮類物質(zhì)的積累量越高，其抗氧化能力最強[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)蕎麥4個不同部位的抗氧化能力存在顯著差異，以花序最高，葉柄最低，且總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與DPPH·清除能力、FRAP抗氧化能力以及ABTS+·清除能力的相關(guān)系數(shù)均在0.98以上，但花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與抗氧化能力的相關(guān)系數(shù)僅為0.530～0.601。前人在紫薯的研究中發(fā)現(xiàn)，不能單獨利用花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)解釋抗氧化能力的強弱，而是由多種生物活性物質(zhì)(如酚類化合物、維生素C和胡蘿卜素等)綜合決定[30-32]，在本次研究中，發(fā)現(xiàn)葉柄中雖積累大量的花青素，但其總酚和總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，從而導(dǎo)致其抗氧化能力顯著低于含有較高總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葉片和子葉。因此，全面準(zhǔn)確地分析蕎麥不同部位抗氧化能力對指導(dǎo)其開發(fā)利用具有重要價值。

4 結(jié) 論

該紅花甜蕎品種‘HHTQ’具有鮮紅的表型性狀，且其花序、葉柄、葉片和子葉中花青素、總酚、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其體外抗氧化能力差異較大，該品種的花青素類型以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷2種為主，且花青素單體的積累具有組織特異性，花序中矢車菊素-3-O-蕓香糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其他部位，同時抗氧化能力最強。葉片和子葉中均積累了一定量的多酚類物質(zhì)，具有較強的抗氧化能力。鑒于該品種具有豐富的酚類物質(zhì)和較強的抗氧化活性，可以將其作為蕎麥茶新產(chǎn)品和天然抗氧化劑資源進行開發(fā)利用。