中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵巢組織學(xué)特征和血液生化指標(biāo)變化規(guī)律

周 劍，李 強(qiáng)，柯紅雨，劉 超，蘇旭濤，肖 宇，孫甲華，王新宇，張 露

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 成都 611731)

【研究意義】中華沙鰍(Sinibotiasuperciliaris)主要分布于長(zhǎng)江中上游水系，肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值兼?zhèn)?；其體態(tài)纖細(xì)，色彩艷麗，在觀賞魚(yú)市場(chǎng)也有良好的前景[1]。近年來(lái)，中華沙鰍由于過(guò)度捕撈，加之修建水利工程等對(duì)其自然繁殖環(huán)境的破壞，使其野生資源逐步減少，單價(jià)逐年上漲?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，對(duì)中華沙鰍的研究主要集中在中華沙鰍的資源現(xiàn)狀[2]、人工馴養(yǎng)和繁殖技術(shù)[3]、繁殖生物學(xué)[4-5]、消化系統(tǒng)結(jié)和功能[6]、胚胎發(fā)育[7]、年齡與生長(zhǎng)[8]、食性[9]、營(yíng)養(yǎng)成分[10]、疾病防治[11]、微衛(wèi)星[12-13]、線粒體[14]以及遺傳多樣性[15]等多個(gè)方面。動(dòng)物繁殖性能相關(guān)的研究一直備受關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的繁殖性能與血液生化指標(biāo)存在較強(qiáng)的相關(guān)性，總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、總膽固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)等指標(biāo)與鴨的繁殖性能均存在一定相關(guān)性[16-17]，而CHOL、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)等指標(biāo)在鶴不同繁殖期也存在較大差異[18]。繁殖過(guò)程中魚(yú)類(lèi)會(huì)通過(guò)血液生理生化指標(biāo)的改變來(lái)適應(yīng)生理需要，已有的研究表明TP、ALB、GLO和血糖(GLU)等指標(biāo)與性腺發(fā)育存在密切關(guān)系，血液生化指標(biāo)的測(cè)定對(duì)于魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育時(shí)期的判定和提高人工繁殖技術(shù)都具有重要意義[19-20]。關(guān)于魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育的研究歷來(lái)受到重視，了解魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育規(guī)律及其特點(diǎn)是魚(yú)類(lèi)繁殖生理學(xué)中最為基礎(chǔ)的工作內(nèi)容。中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵巢組織學(xué)變化特征和血液生化指標(biāo)變化規(guī)律的研究尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文通過(guò)對(duì)中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵巢組織學(xué)特征和血液生化指標(biāo)變化規(guī)律進(jìn)行探討。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】旨在為中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵母細(xì)胞變化規(guī)律、不同時(shí)期的卵徑和血液生化指標(biāo)提供參考數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探究中華沙鰍繁殖過(guò)程中的卵巢發(fā)育特點(diǎn)、提高中華沙鰍繁殖力和了解其繁殖期健康狀況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

按照中華沙鰍的產(chǎn)卵特點(diǎn)將其整個(gè)繁殖過(guò)程分為繁殖前期(3-4月)、繁殖期(5-7月)、繁殖后期(8-9月)3個(gè)時(shí)期，分別于3、6、8月中旬采集不同時(shí)期雌性中華沙鰍血液樣本和不同時(shí)期完整卵巢組織各5例，組織樣本用4 %多聚甲醛固定備用，采用斷尾采血法收集血液樣本，置于1.5 mL離心管中，經(jīng)靜置后采用3000 r/min離心15 min，分離血清后，-80 ℃保存待測(cè)。試驗(yàn)所用中華沙鰍個(gè)體均為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所人工培育達(dá)到性成熟的3齡中華沙鰍雌性個(gè)體，所用中華沙鰍體重范圍為(13±3) g，體長(zhǎng)范圍為(11±3) cm。

1.2 組織切片制作和圖像采集

固定后的卵巢組織經(jīng)脫水，石蠟包埋后，制成5～7 μm厚的切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，中性樹(shù)膠封片。采用數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(BA200Digital，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)分別采集100和400倍放大切片圖片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀測(cè)每個(gè)視野中所有卵母細(xì)胞。

1.3 血液生化指標(biāo)檢測(cè)

本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了9項(xiàng)血液生化指標(biāo)，分別為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(CHOL)等血液生化指標(biāo)，以上指標(biāo)均采用全自動(dòng)生化分析儀(TC6010L，江西特康科技有限公司)進(jìn)行測(cè)定，酶類(lèi)采用速率法，其他為終點(diǎn)法[20]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

組織切片采用 Image Pro Plus 5.1(MediaCybernetics, Bethesda, MD, USA)圖像分析軟件對(duì)各時(shí)相的卵母細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)。參考前人研究方法，根據(jù)中華沙鰍卵巢的組織學(xué)特征，將卵母細(xì)胞分為6個(gè)時(shí)相[21]。用JMP10.0.2(SAS Institute Inc. Cary, NC)軟件對(duì)不同時(shí)期的血液生化指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果采用最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(χ±Sχ)表示，采用Student’ t法進(jìn)行檢驗(yàn)，取P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華沙鰍繁殖前期卵巢組織學(xué)特征

繁殖前期卵母細(xì)胞呈小葉狀分布，卵母細(xì)胞間有毛細(xì)血管和結(jié)締組織構(gòu)成的間質(zhì)，以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖1A)。第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞直徑約50～110 μm，胞核直徑約11～30 μm，胞體較小，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)呈嗜堿性反應(yīng)，染色后呈深藍(lán)色，胞核明顯，分布在細(xì)胞中央，核仁多個(gè)，多靠近核膜內(nèi)側(cè)分布；第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞直徑約110～260 μm，胞核平均直徑約70～105 μm，胞體較大，屬于初級(jí)卵母細(xì)胞的大生長(zhǎng)期，細(xì)胞質(zhì)為弱嗜堿性，染色后呈粉色，胞質(zhì)內(nèi)靠胞膜邊緣有空泡狀小泡，胞核明顯，多數(shù)第Ⅲ時(shí)相細(xì)胞胞核位于細(xì)胞中央(圖1B)。

A：繁殖前期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞，HE，×100；B：繁殖前期卵巢，示細(xì)胞核(N)、核仁(Nu)、放射帶(ZR)、濾泡細(xì)胞(FC)，HE，×400；C：繁殖期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞、授精孔(FH)，HE，×100；D：繁殖期卵巢，示第Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞卵黃顆粒(YG)、放射帶(ZR)，HE，×400；E：繁殖后期卵巢，示第Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞，HE，×100；F：繁殖后期卵巢，HE，×400A: Ovarian tissue in pre-spawning stage, showing the phase Ⅱand Ⅲ oocytes, HE. ×100; B: Ovarian tissue in pre-spawning stage, showing the cell nucleus (N), nucleolus (Nu), zona radiata (ZR), follicular cell (FC), HE. ×400; C: Ovarian tissue in spawning stage, showing the phaseⅡ, Ⅲ, Ⅳ, and Ⅴoocytes, fertilization hole (FH), HE. ×100; D: Ovarian tissue in spawning stage, showing the yolk granules (YG) and zona radiata (ZR) of phase Ⅳ oocytes, HE. ×400; E: Ovarian tissue in post-spawning stage, showing the phase Ⅱ, Ⅲ and Ⅵ oocytes, HE. ×100; F: Ovarian tissue in post-spawning stage, HE. ×400圖1 中華沙鰍卵巢組織切片F(xiàn)ig.1 Observation of ovarical histological structure for Sinibotia superciliaris in three breeding stages

2.2 中華沙鰍繁殖期卵巢組織學(xué)特征

繁殖期以第Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見(jiàn)少數(shù)第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖1C)。第Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞為初級(jí)卵母細(xì)胞大生長(zhǎng)期的后階段，即生長(zhǎng)成熟階段。細(xì)胞體積明顯增大，第Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞直徑約570～720 μm。第Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中卵黃不斷積累由細(xì)胞的邊緣逐漸向中央擴(kuò)展，最終充滿整個(gè)細(xì)胞，而且卵黃顆粒不僅數(shù)量增加，體積也不斷增大，隨著卵母細(xì)胞的成熟，構(gòu)成濾泡膜的兩層濾泡細(xì)胞更加明顯，并且內(nèi)層濾泡細(xì)胞變得比外層濾泡細(xì)胞圓而大，放射膜增厚(圖1C、D)。 第Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大的卵黃顆粒，體積明顯增大，卵母細(xì)胞直徑約700～950 μm。第Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞中卵黃顆粒已充滿整個(gè)卵母細(xì)胞并融合成板塊狀，核膜、核仁均消失，核質(zhì)與動(dòng)物極胞質(zhì)融合。

2.3 中華沙鰍繁殖后期卵巢組織學(xué)特征

繁殖后期卵巢中以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量的第Ⅲ時(shí)相和第Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞，核周細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡(圖1E)。第Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞細(xì)胞形狀不規(guī)則，體積變小，濾泡細(xì)胞增多、肥大，卵黃潰散、液化，放射膜模糊不清，細(xì)胞核消失或處于消失過(guò)程中，核膜崩解，卵膜變形、破裂，卵母細(xì)胞發(fā)生明顯變形萎縮(圖1F)。

2.4 繁殖過(guò)程中血液生化指標(biāo)變化規(guī)律

中華沙鰍繁殖過(guò)程中CHOL、TG、ALB等血液生化指標(biāo)呈先上升后降低趨勢(shì)，ALP則呈現(xiàn)出先降低后上升的變化趨勢(shì)，ALT、GLU、TP、GLO等血液生化指標(biāo)呈逐漸上升趨勢(shì)， 而AST則呈逐漸下降的變化趨勢(shì)，中華沙鰍繁殖過(guò)程中所檢測(cè)的各項(xiàng)血液生化指標(biāo)雖然都有所變化，但均未呈現(xiàn)出顯著差異，各項(xiàng)血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討 論

3.1 中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵巢組織學(xué)特征

關(guān)于魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育分期方法眾多，許多學(xué)者在前蘇聯(lián)學(xué)者B.A.Meйeн(1939)分期方法的基礎(chǔ)上不斷加以改進(jìn)和完善，根據(jù)卵母細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征，將其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程分為 6 個(gè)時(shí)相，其方法、內(nèi)容和名稱(chēng)日趨一致[21]。因此，本文參考前人研究方法，將中華沙鰍的卵細(xì)胞的形成分為 6 個(gè)時(shí)相，即卵原細(xì)胞期、單層濾泡期、卵黃泡期、卵黃充滿期、成熟期和退化期。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中華沙鰍繁殖前期其卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞；繁殖期以第Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見(jiàn)少數(shù)第Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞；繁殖后期卵巢中以第Ⅱ時(shí)相和第Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見(jiàn)少量第Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞。在繁殖過(guò)程中，中華沙鰍卵母細(xì)胞從第Ⅱ時(shí)相生長(zhǎng)發(fā)育到第Ⅴ時(shí)相基本上是同步的，繁殖后期的卵巢以第Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見(jiàn)排卵后留下來(lái)的濾泡膜和結(jié)締組織，有少量未產(chǎn)出的卵母細(xì)胞退化后形成的第Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞，沒(méi)有或很少有次發(fā)性的Ⅲ時(shí)相和Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞，符合一次性產(chǎn)卵魚(yú)類(lèi)特征，試驗(yàn)結(jié)果與楊明生等所推測(cè)的中華沙鰍為一次性產(chǎn)卵魚(yú)類(lèi)的觀點(diǎn)一致[22]。

表1 中華沙鰍繁殖過(guò)程中不同時(shí)期血液生化指標(biāo)(最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 1 Blood biochemical indices of Sinibotia superciliaris in different stages during the breeding process (χ±Sχ)

已有研究發(fā)現(xiàn)卵徑大小能夠直接影響孵化后魚(yú)苗的生長(zhǎng)和存活率[23]，因此對(duì)魚(yú)類(lèi)繁殖過(guò)程中卵徑進(jìn)行測(cè)定和分析具有重要的意義。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示中華沙鰍繁殖前期卵母細(xì)胞體積逐漸變大，大部分卵母細(xì)胞開(kāi)始由小生長(zhǎng)期向營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)備的大生長(zhǎng)期過(guò)渡，發(fā)育至繁殖期大部分的卵母細(xì)胞中卵黃顆粒大量沉積，卵母細(xì)胞體積顯著增大，而繁殖后期卵巢中未能順利排卵的卵母細(xì)胞會(huì)退化并被吸收，逐漸出現(xiàn)變形萎縮。中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵母細(xì)胞變化特征與大多數(shù)魚(yú)類(lèi)相似，但不同魚(yú)類(lèi)各時(shí)相卵母細(xì)胞的大小均有所不同。楊明生等[22]曾在體視顯微鏡下對(duì)性腺發(fā)育至 Ⅳ期收集自金沙江流域中華沙鰍卵巢中的1000粒卵的卵徑進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)定卵徑范圍在200～1400 μm。而本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵徑范圍在50～950 μm，卵徑略小于金沙江流域采集的中華沙鰍卵徑，可能是由于實(shí)驗(yàn)采用中華沙鰍的個(gè)體大小、生長(zhǎng)環(huán)境、養(yǎng)殖方式和性腺發(fā)育程度不同等多種原因?qū)е隆Ｔ邛q科魚(yú)類(lèi)中，大鱗副泥鰍第Ⅲ、Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞直徑范圍在191～870 μm[24]，長(zhǎng)薄鰍第Ⅲ時(shí)相到第Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞直徑范圍在235～1185 μm[25]，比較發(fā)現(xiàn)中華沙鰍卵母細(xì)胞直徑小于同為鰍科魚(yú)類(lèi)的大鱗副泥鰍和長(zhǎng)薄鰍。通過(guò)對(duì)中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵巢組織學(xué)特征的研究，為其不同時(shí)期卵巢發(fā)育特點(diǎn)和卵母細(xì)胞卵徑大小提供了參考數(shù)據(jù)

3.2 繁殖過(guò)程中血液生化指標(biāo)變化規(guī)律

魚(yú)類(lèi)血液生化指標(biāo)不僅能反映魚(yú)類(lèi)的物種特征及生理狀態(tài)，還能為繁殖和病理研究等提供重要參考依據(jù)[26]。在繁殖過(guò)程中，魚(yú)類(lèi)會(huì)通過(guò)血液生理生化指標(biāo)的改變以適應(yīng)繁殖期間的生理需要，血液生化指標(biāo)對(duì)反映動(dòng)物生理功能正常與否具有重要的指示作用[19]。肝臟是機(jī)體代謝和能量產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，繁殖期間內(nèi)分泌機(jī)能的改變和對(duì)能量需求的增加，肝臟功能異常很可能影響魚(yú)類(lèi)卵巢的成熟及排卵活動(dòng)[27]。肝臟是TP、ALB和GLO合成的主要場(chǎng)所，ALT和AST是目前肝功能檢查常用的重要血清酶學(xué)指標(biāo)，這些血液生化指標(biāo)的變化可以從一定程度上反應(yīng)肝臟的代謝能力[28]，可有效地了解繁殖過(guò)程中中華沙鰍的健康狀況。此外，血液生化指標(biāo)的測(cè)定還可用于魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育時(shí)期的判定，研究表明用ALB/GLO、TP和鈣離子(Ca2+)水平來(lái)判斷施氏鱘卵巢發(fā)育階段的判別準(zhǔn)確率可達(dá)100 %[29]，而用血液淀粉酶(AMS)、Ca2+、肌酐(CR)和GLU來(lái)判斷西伯利亞鱘雌魚(yú)性腺發(fā)育時(shí)期的判別準(zhǔn)確率也可達(dá)100%[20]。

魚(yú)類(lèi)血漿中各類(lèi)蛋白含量與性腺發(fā)育過(guò)程相關(guān)，與卵黃蛋白原的含量存在線性關(guān)系[30]，已有研究發(fā)現(xiàn)ALB水平在西伯利亞鱘性腺發(fā)育和鯔魚(yú)繁殖過(guò)程中均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，在產(chǎn)卵前ALB水平達(dá)到最高，產(chǎn)卵后ALB水平逐漸下降[20, 31]，本試驗(yàn)中華沙鰍繁殖過(guò)程中ALB也同樣呈現(xiàn)出了先上升后降低趨勢(shì)。在施氏鱘卵巢發(fā)育過(guò)程中AST/ALT呈顯著下降趨勢(shì)，GLU呈先上升后降低趨勢(shì)，而ALB和CHOL則呈逐漸上升趨勢(shì)[29]，本試驗(yàn)中華沙鰍繁殖過(guò)程中AST/ALT也呈現(xiàn)出了逐漸下降趨勢(shì)的變化趨勢(shì)，而中華沙鰍繁殖過(guò)程中GLU呈逐漸上升趨勢(shì)，ALB和CHOL呈先上升后降低趨勢(shì)，這與施氏鱘存在一定差異。在中華沙鰍繁殖過(guò)程中所檢測(cè)的血液生化指標(biāo)雖未呈現(xiàn)出顯著差異，但仍出現(xiàn)了一定變化，可能是由于繁殖期間內(nèi)分泌機(jī)能的改變和對(duì)能量需求的增加，肝臟的代謝效率也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致ALT和AST等指標(biāo)也會(huì)隨之發(fā)生變化。此外，魚(yú)類(lèi)在繁殖過(guò)程中卵巢發(fā)育所消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要為脂類(lèi)物質(zhì)[32]，隨著卵巢發(fā)育對(duì)能量需求的增加，機(jī)體會(huì)將更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷轉(zhuǎn)化為能量以維持自身正常的生理活動(dòng)，從而導(dǎo)致TP、GLU、CHOL等水平也不斷發(fā)生改變。然而魚(yú)類(lèi)血液生化指標(biāo)不僅受年齡、性別、繁殖和食性等內(nèi)源性因素影響，還會(huì)受到餌料、溶氧、溫度、養(yǎng)殖方式和疾病等環(huán)境因子影響[19]，不同種屬魚(yú)類(lèi)繁殖過(guò)程中的代謝存在較大差異，血液生化指標(biāo)變化規(guī)律也存在一定差異，中華沙鰍繁殖過(guò)程中生化代謝機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本文對(duì)中華沙鰍繁殖前期、繁殖期和繁殖后期卵巢組織學(xué)特征和血液生化指標(biāo)變化規(guī)律進(jìn)行了研究，對(duì)中華沙鰍繁殖過(guò)程中不同時(shí)期卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞組成和發(fā)育變化規(guī)律進(jìn)行了探討，測(cè)定了不同時(shí)相的卵母細(xì)胞直徑，并對(duì)不同時(shí)期的ALT、AST、ALP、CHOL、TG、GLU、TP、ALB、GLO等血液生化指標(biāo)變化規(guī)律進(jìn)行了總結(jié)，該結(jié)果為中華沙鰍繁殖過(guò)程中卵母細(xì)胞變化規(guī)律、不同時(shí)期的卵徑和血液生化指標(biāo)提供參考數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探究中華沙鰍繁殖過(guò)程中的卵巢發(fā)育特點(diǎn)、提高中華沙鰍繁殖力和了解其繁殖期健康狀況提供理論依據(jù)。