番茄漆斑病病原鑒定及防治藥劑室內活性篩選

霍建飛,郝永娟,楊秀榮,姚玉榮,孫淑琴,劉春艷,王萬立

(天津市植物保護研究所，天津 300384)

【研究意義】番茄是我國設施蔬菜中普遍種植的蔬菜，由于其營養(yǎng)價值高、口感好而備受人們喜愛。由于蔬菜大棚種植年限增加以及環(huán)境變化，在番茄上出現(xiàn)了一些新病害。2013年12月在天津市植保所武清創(chuàng)新基地溫室番茄上發(fā)現(xiàn)一種新病害，該病主要危害葉片，嚴重時病斑連片，病斑褐色至深褐色，圓形至橢圓型，病斑處下陷，病斑正面具有同心輪紋，該病嚴重影響了番茄的產(chǎn)量及質量。對引起該病的病原菌進行鑒定，并對該菌進行室內藥劑篩選試驗，篩選高效的化學藥劑，以期為防治該病害提供理論依據(jù)，對于田間有效防治該病害具有重要意義。 【前人研究進展】目前關于植物病害鑒定的研究較多，傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定與分子生物學相結合的方法已廣泛應用于植物病害病原的鑒定，如根腐病菌(Fusariumsporotrichioide)[1]、褐斑病菌(Alternariaalternata)[2]炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)[3-4]，在番茄病害方面，番茄頸腐根腐病[5]、番茄枯萎病[6]、番茄白粉病[7]等也通過形態(tài)學特征結合rDNA-ITS 序列分析的方法鑒定出病原菌。在天津市植物保護研究所武清創(chuàng)新基地大棚中發(fā)現(xiàn)的番茄葉部病害與趙彥杰等[8]于2006-2008年在北京地區(qū)蔬菜種植基地發(fā)現(xiàn)的番茄漆斑病(病原為Myrotheciumroridum)癥狀相似，但是否由M.roridum引起還有待明確。【本研究切入點】本研究采用真菌形態(tài)學及對病菌DNA的ITS區(qū)進行序列分析相結合的方法對引起該病的病原菌進行準確鑒定，并對該菌進行室內藥劑篩選試驗，【擬解決的關鍵問題】以期篩選出高效的化學藥劑，為科學防治該病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄：番茄品種為“天冠”(購買于天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)佳信興農(nóng)農(nóng)資店)， 番茄病葉于2013年12月在天津市植物保護研究所所武清創(chuàng)新基地溫室中發(fā)現(xiàn)，2013年12月10日采集病葉用于病原的分離鑒定。

供試藥劑：10 %苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole)水分散粒劑，東莞市瑞德豐生物科技有限公司；430 g/L戊唑醇(tebuconazole)懸浮劑、41.7 %氟吡菌酰胺(fluopyram)懸浮劑，德國拜耳作物科學公司；80 %多菌靈(carbendazim)可濕性粉劑，河北省化學工業(yè)研究院；250 g/L吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)乳油、50 %醚菌酯(kresoxim-methyl)水分散粒劑，巴斯夫歐洲公司；250 g/L嘧菌酯(azoxystrobin)懸浮劑，先正達(蘇州)作物保護有限公司；德國拜耳作物科學公司(紅字應去掉)75 %百菌清(chlorothalonil)可濕性粉劑，江蘇省新沂市科大農(nóng)藥廠；45 %咪鮮胺(prochloraz)水乳劑，北京北農(nóng)天風農(nóng)藥有限公司。供試試劑：NaCl，Tris-HCl，EDTA，PVP，CTAB，β-巰基乙醇，氯仿，異戊醇，NaAc，75 %乙醇，瓊脂糖等均為國產(chǎn)分析純。Goldview、Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒均為康為世紀公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基： 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，簡稱PDA)(1L 水中含葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂18 g)。儀器：Eclipse 80i熒光顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；Bio-RAD電泳儀，北京伯樂生命科學發(fā)展有限公司；Sigma3K15離心機，美國Sigma公司；KodakGellogic 2200 凝膠成像儀，Kodak公司；RXZ-280C型人工氣候箱，寧波江南儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離、純化及形態(tài)學鑒定 在無菌條件下將病葉病斑剪下用5 %次氯酸鈉溶液表面消毒1～2 min，用無菌水沖洗3次，置于PDA平板培養(yǎng)基上25 ℃下恒溫培養(yǎng)，約2～3 d長出菌絲后挑取邊緣菌落進行純化。待菌絲生長產(chǎn)生分生孢子后，將分生孢子挑入滅菌蒸餾水中，配制成濃度約為1.0×106個/mL的孢子懸浮液，用滅菌毛細管吸取少量孢子懸浮液于PDA平板上，置于25 ℃下培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)基上形成的微小菌落，將由單個孢子形成的微小菌落及周圍培養(yǎng)基一起切下，轉入另一PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以獲得該病原菌的單孢純化菌株[9]。

觀察純化的病原菌在PDA平板上的菌絲形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢情況及孢子形狀、大小、產(chǎn)孢器、孢子梗等形態(tài)特征。

1.2.2 病原菌的致病性測定 將純化的菌株挑入PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其產(chǎn)生分生孢子后將其配制成濃度約為1.0×106個/mL的孢子懸浮液，將其均勻噴施到健康番茄植株(提前在營養(yǎng)缽中育好的番茄苗，苗齡約30 d)葉片上，接種后置于人工氣候箱中培養(yǎng)(白天14 h，溫度25 ℃，相對濕度95 %；夜間10 h，22 ℃，相對濕度90 %)，觀察并記錄發(fā)病情況。待其發(fā)病后再次分離病原菌，并與原接種菌株進行比較。

1.2.3 分子生物學鑒定 采用易潤華等[10]的CTAB法提取病原菌DNA。用滅菌的牙簽挑取50 mg左右新鮮菌絲于研缽中，加600 μl CTAB提取緩沖液(含0.7 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，20 mmol/L EDTA，10 g/LPVP，20 g/LCTAB，0.1 %β-巰基乙醇)，充分研磨后移入1.5 mL的Eppendorf管中，于水浴鍋中65 ℃下保溫30 min，加等體積氯仿/異戊醇混合液[V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1]充分搖勻，4 ℃下10 000 r/min離心5 min。移取上清液至新的Eppendorf管中，加10 %體積的3 mol/L pH 6.0 NaAc溶液和2.5倍體積的冰凍乙醇，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用70 %的酒精洗2～3次，晾干，加TE緩沖液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L pH 8.0 EDTA)充分溶解后，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR引物為真菌核糖體DNA(rDNA)的ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4，引物序列(北京三博遠志生物技術有限責任公司合成如下：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR體系為50 μl：25 μl Mixture混合液，100 ng/μl模板DNA 2 μl，10 μmol/L引物ITS1 和ITS4各2 μl，ddH2O 19 μl。PCR反應條件：95 ℃ 預變性 5 min；95 ℃ 變性45 s，56 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，置4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物在1.2 %瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL Goldview) 中電泳，凝膠成像儀上照相并保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒回收純化后委托金唯智生物科技有限公司進行克隆及測序。

1.2.4 病原菌室內藥劑篩選 采用平皿法[11]測定不同藥劑對番茄油漆斑病菌的抑菌率。供試藥劑(1.1材料中的供試藥劑)直接用水溶解稀釋，根據(jù)藥劑活性，各藥劑設置的系列質量濃度不同(10 %苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑設置濃度分別為200、100、50、10、1、0.1 μg/mL；430 g/L戊唑醇懸浮劑設置濃度分別為200、100、50、10、1、0.1 μg/mL；41.7 %氟吡菌酰胺(懸浮劑設置濃度分別為10、1、0.5、0.1、0.01 μg/mL；80 %多菌靈可濕性粉劑設置濃度分別為10、5、1、0.1、0.01 μg/mL；250 g/L吡唑醚菌酯乳油設置濃度分別為100、50、10、1、0.1、0.01 μg/mL；50 %醚菌酯水分散粒劑設置濃度分別為100、50、10、1、0.1、0.01 μg/mL；250 g/L嘧菌酯懸浮劑設置濃度分別為100、50、10、1、0.1、0.01 μg/mL；75 %百菌清可濕性粉劑設置濃度分別為200、100、50、10、1 μg/mL；45 %咪鮮胺水乳劑設置濃度分別為100、50、10、1、0.1 μg/mL)。在無菌操作下，根據(jù)試驗處理吸取預先融化的滅菌培養(yǎng)基36 mL加入到無菌50 mL三角瓶中，從低濃度到高濃度依次吸取4 mL藥液，分別加入上述三角瓶中，充分搖勻。然后等量倒入3個培養(yǎng)皿中(直徑為9 cm)，制成相應濃度的含藥平板。設不含藥劑的處理作為空白對照，每個處理3個重復。

將培養(yǎng)好的病原菌在無菌條件下用滅菌打孔器(直徑為3 mm)在菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種于含藥平板中央，菌絲面朝上，蓋上皿蓋，置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后，用卡尺測量菌落直徑，每個菌落用十字交叉法垂直測量直徑各1次，取其平均值，試驗設3個重復。計算各藥劑對番茄漆斑病菌的抑菌率 ，利用SPSS19.0軟件計算EC50、EC90及毒力回歸方程。抑菌率= (空白對照菌落半徑-藥劑處理菌落半徑 )/空白對照菌落半徑×100 %。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀、病原菌的分離純化及形態(tài)學特征

該病斑褐色或深褐色，橢圓形至圓形，病斑處下陷，有的病斑周圍具有黃色暈圈，病斑正面具有同心輪紋(圖1-a)；經(jīng)分離培養(yǎng)該菌在PDA平板上形成的菌落顏色初為白色，絨毛狀，26 ℃下培養(yǎng)5 d以后開始產(chǎn)生黑色或墨綠色的油漆狀分生孢子堆(圖1-b)，菌落背面為淡黃色(圖1-c)；分生孢子座淺杯狀，無剛毛(圖1-d)，分生孢子梗叢生，帚狀(圖1-e)，分生孢子單胞，桿狀，無色，兩端各有1～2個小油球，PDA平板培養(yǎng)狀態(tài)下孢子大小為 (6.33～9.00) μm×(1.28～2.33) μm(圖1-f)。根據(jù)形態(tài)學特征，該病菌初步鑒定為露濕漆斑菌Myrotheciuroridum

a：番茄漆斑病典型病斑； b：PDA平板培養(yǎng)的正面菌落；c：PDA平板培養(yǎng)的背面菌落； d：分生孢子座；e：分生孢子梗；f：分生孢子a: Typical lesions on tomato leaves; b: Positive mycelium colony cultured on the PDA plate; c: Reverse mycelium colony cultured on the PDA plate; d: Sporodochium; e: Conidiophores; f: Conidiospores圖1 番茄漆斑病癥狀及病原菌的形態(tài)學特征Fig.1 Symptom s of tomato myrothecium leaf spot and morphological characteristics of Myrothecium roridum

a：病原菌回接番茄葉片癥狀；b：病原菌回接番茄莖癥狀；c：病原菌回接番茄葉片后分離的病原菌a: Symptom developed on tomato leaf by artificial inoculation; b: Symptom developed on tomato stem by artificial inoculation; c: Pathogen mycelium colony isolated from inoculated tomato leaves圖2 病原菌回接番茄后癥狀及分離的病原菌Fig.2 Symptom on tomato leaves by artificial inoculation and pathogen isolated from inoculated tomato leaves

2.2 病原菌致病性測定

將分離得到的病原菌孢子懸浮液噴施于健康植株番茄葉片及莖上，6 d后葉片的病斑癥狀與田間發(fā)病癥狀(圖1-a)相似，且番茄莖上也出現(xiàn)凹陷病斑(圖2-b)；從接種發(fā)病的植株葉片及莖上分離的病原菌與前期接種菌株培養(yǎng)性狀相同(圖2-c)，根據(jù)柯赫氏法則，接種的病原菌即為從田間番茄葉片上分離純化的病原菌。

2.3 分子生物學鑒定

使用真菌核糖體DNA的18S區(qū)域引物ITS1和ITS4擴增出了大小為600 bp左右的片段(圖3)，將擴增產(chǎn)物克隆測序后拼接，獲得該病原菌的最終ITS序列。將該序列輸入NCBI中進行nucleotide blast比對分析，結果顯示，該序列與NCBI庫中的露濕漆斑菌(GenBank登錄號為AB823653.1和EU927366.1)同源性達到99 %，綜合形態(tài)學特征確定該致病菌為露濕漆斑菌M.roridum。

M：DL2000 DNA標準分子量；S：分離的病原菌 M: DL2000 DNA marker; S: Isolated fungi圖3 分離的病原菌PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of PCR products of isolated fungi on tomato leaf

2.4 室內藥劑篩選

氟吡菌酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和多菌靈對番茄漆斑菌菌絲的抑菌作用很強，其EC50分別為0.094、0.781、1.041和1.396 μg/mL；醚菌酯、咪鮮胺水乳劑對番茄漆斑菌菌絲的抑菌作用較強，其EC50分別為4.936和8.479 μg/mL；戊唑醇和苯醚甲環(huán)唑對菌絲的抑制作用略差，其EC50分別為16.018和21.584 μg/mL；百菌清對病原菌的抑菌活性最差，其EC50大于100，基本無活性(表1)。

室內藥劑篩選試驗表明，在氟吡菌酰胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯和多菌靈等4種抑菌活性較好的殺菌劑中，氟吡菌酰胺的EC50和EC90均最小，表明氟吡菌酰胺對番茄漆斑病菌菌絲的抑制能力最強；雖然多菌靈的EC50大于嘧菌酯及吡唑醚菌酯，但其EC90(2.057 μg/mL)遠小于嘧菌酯SC(EC90>100)和吡唑醚菌酯(EC90為77.287)，這說明多菌靈對番茄漆斑病菌菌絲生長的抑菌活性大于嘧菌酯和吡唑醚菌酯。

3 結論與討論

目前，隨著環(huán)境變化，植物上出現(xiàn)了一些新病害。由露濕漆斑菌引起的番茄漆斑病(也稱漆腐病)最早是由Stevenson & McCollochL于1947年在美國德克薩斯州的番茄果實上首次發(fā)現(xiàn)[12]，隨后有報道稱，該菌可引起番茄果實腐爛[13-14]。而國內由露濕漆斑菌引起的植物病害的相關報道較少，堵鶴鳴等在1988年首次發(fā)現(xiàn)該菌可引起桑樹漆斑病[15]，2009年賁海燕等[16]對引起瑞典常春藤(Pelctranthusoertendahlii)漆斑病的病原鑒定，確定病原為露濕漆斑菌。李寶聚和趙彥杰[17]在山東青州、北京大興以及遼寧海城等溫室茄子種植區(qū)，發(fā)現(xiàn)有茄子漆斑病發(fā)生，并將其病原鑒定為露濕漆斑菌。近兩年來陸續(xù)有報導該菌可引起山藥漆腐葉斑病[18]

表1 9種殺菌劑對番茄漆斑病菌的室內毒力測定Table 1 Determination of the virulence of nine fungicides to Myrothecium roridum in vitro

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準差/標準誤。
Note : Data in the table are mean±SD/SE.

和鐵皮石斛漆斑病[19]。而在我國由露濕漆斑菌引起的番茄漆斑病自趙彥杰等[8]在2009年報道以后，還未有其它報道，本試驗中番茄漆斑病的癥狀及病原菌形態(tài)學特征與趙彥杰等[8]所做試驗結果相一致。

吡唑醚菌酯、嘧菌酯和醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[20]，通過阻止細胞色素bc1復合物中的電子傳遞而阻止ATP的合成，抑制真菌細胞中能量產(chǎn)生，干擾呼吸從而達到抑制真菌孢子萌發(fā)或菌絲生長[21-22]。本試驗中吡唑醚菌酯和嘧菌酯的EC50較小，對番茄漆斑病菌菌絲的抑制率好于醚菌酯，可以作為番茄漆斑病防治藥劑，至于番茄漆斑病菌菌絲為何對醚菌酯不敏感，還有待于進一步研究；多菌靈是苯并咪唑類殺菌劑，從20世紀60 年代開始廣泛用于防治植物病害，該類藥物的作用機制主要是與病原菌的微管蛋白結合，從而阻礙病菌的有絲分裂[23]，雖然多菌靈用藥歷史悠久，長期使用病原菌易產(chǎn)生抗藥性[24-25]，但其具有高效低毒的優(yōu)點，對于防治新病害或病害防治初期可以嘗試使用；氟吡菌酰胺是一種新型吡啶基乙基苯甲酰胺類殺菌劑，通過阻礙呼吸鏈中琥珀酸脫氫酶的電子轉移而抑制線粒體呼吸[26]，氟吡菌酰胺可用于防治70多種作物上的病害，F(xiàn)ought et al.[27]和Klages et al.[28]證實氟吡菌酰胺對核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)、叢梗孢屬病菌(Monilia)和白粉病菌(Erysiphe)所引起的病害防效優(yōu)異，而在我國陳彥等[29]證實氟吡菌酰胺對黃瓜、草莓白粉病防效達90 %以上，對甜瓜白粉病的防效達95 % 以上，而本試驗中氟吡菌酰胺對番茄漆斑病菌的EC50為0.094 μg/mL，而其EC90僅為0.627 μg/mL，說明氟吡菌酰胺對番茄漆斑病菌的抑菌活性很高。因此，氟吡菌酰胺可以作為番茄漆斑病的有效防治藥劑。

殺菌劑室內毒力測定應該使用原藥進行試驗，因實驗室中缺乏部分原藥，為了保證試驗的一致性，本試驗中的藥品采用制劑代替，雖然并不能完全反映出藥劑對露濕漆斑菌菌絲的抑制作用，但也能反映出藥劑本身對露濕漆斑菌菌絲的抑制趨勢。由于本試驗番茄漆斑病菌藥劑篩選試驗是在室內進行，因此在應用到田間生產(chǎn)之前，需進一步開展田間藥效試驗來驗證藥劑對病害的防治效果，還要考慮藥劑對植物和環(huán)境的影響、成本及抗藥性等諸多因素，力求合理高效地使用殺菌劑。