河南省花生品種(系)基于SSR分子標記的遺傳多樣性研究

楊海棠，胡延嶺，李 盼，劉軟枝，廖先靜，朱麗麗，韓華民

(鄭州市農(nóng)林科學研究所，河南 鄭州 450005)

花生是我國重要的經(jīng)濟作物和油料作物，也是河南省第三大作物，種植面積僅次于玉米和小麥。河南省是我國花生種植第一大省，近年來花生種植面積占全國種植面積的23%，產(chǎn)量占全國花生總產(chǎn)的27%[1]。多年來，河南花生研究取得了長足進展，促進了花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展，但隨著花生生產(chǎn)與市場的變化，花生研究中的一些問題日益突出，例如：專用型品種比較缺乏，難以滿足日趨多元化的市場需求，育種材料遺傳基礎(chǔ)有待進一步拓寬[2-4]，種質(zhì)創(chuàng)新與育種技術(shù)研究滯后等，這些問題已成為花生發(fā)展的瓶頸。

在新品種選育中，突破性的品種往往來源于關(guān)鍵遺傳資源的發(fā)現(xiàn)與利用，而這又取決于種質(zhì)的遺傳多樣性和有利基因的頻率。因而，研究花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性具有重要意義。對河南省不同類型花生品種(系)的遺傳多樣性進行分析、評價，有利于對現(xiàn)有種質(zhì)資源有明確認識，同時也可以為花生遺傳資源有效利用和花生新品種選育提供理論依據(jù)。進而可以有目的地利用種質(zhì)資源，有計劃地創(chuàng)造新材料，選育出配合力高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的資源，組配強優(yōu)勢組合，進一步培育優(yōu)良品種。

本研究利用SSR分子標記技術(shù)對河南省近年來正在推廣及新選育的60個包括普通型和珍珠豆型的花生地方品種(系)進行遺傳多樣性研究，采用MEGA 6.0軟件進行聚類分析，為有效利用花生遺傳資源和為育種中合理選擇親本提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料從河南省鄭州、濮陽、開封、漯河、商丘、駐馬店等6個地方相關(guān)育種單位收集的60個不同植物學類型的花生品種(系)，類型及來源地詳見表1，其中，分類上屬于普通型花生52個，珍珠豆型花生8個。2014年5月份種植在河南鄭州須水試驗場，生長期按常規(guī)田間管理進行。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

苗期取花生幼葉，與干燥劑一起放入自封袋。取回的樣品放在-80℃冰箱保存。運用CTAB法提取花生葉片DNA[5]，用于后續(xù)SSR分析。

1.2.2 SSR分析

根據(jù)前人的研究[6-10]，選擇運用200對多態(tài)性較好的SSR引物對60份花生品種(系)的DNA進行擴增。PCR擴增結(jié)果運用ABI 3500XL設(shè)備進行高通量電泳分析，并將電泳結(jié)果根據(jù)特征條帶的分子量大小通過Genographer 2.1軟件轉(zhuǎn)化為模擬條帶，詳細的操作按照軟件使用說明進行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

運用R語言程序包R 3.1.2對特征條帶進行遺傳距離的轉(zhuǎn)化。運用R軟件計算AMOVA遺傳距離，并運用MEGA 6.0軟件中phylogeny下的UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages)進行聚類分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標記在品種間的多態(tài)性情況

200對SSR引物在60份花生品種(系)的擴增結(jié)果表明，擴增結(jié)果為單一條帶的引物為98對，占總引物數(shù)的49%；擴增結(jié)果為兩條帶的引物為85對，占總引物數(shù)的42.5%；擴增結(jié)果為三條帶的引物為17對，占總引物數(shù)的8.5%。全部200對SSR引物在60份花生品種(系)中有較好的擴增效果，均有不同程度的多態(tài)性產(chǎn)生，沒有擴增結(jié)果完全相同的引物出現(xiàn)。

2.2 品種間的相似性

根據(jù)SSR標記數(shù)據(jù)計算60個品種(系)間的遺傳相似系數(shù)在0到1之間(見表2)，平均值為0.3。其中，開19-2與商花10號和開農(nóng)012相似系數(shù)為1，遺傳相似系數(shù)最大，相似性高。此外，有30個組合的遺傳相似系數(shù)達到0.9，分別為：遠雜9807與開農(nóng)49、鄭農(nóng)花12號、漯花4087、漯花4016、1004新品系、豫花9331和豫花9925遺傳相似系數(shù)為0.9。商研9958與商花5號和豫花9719遺傳相似系數(shù)為0.9。漯花4016與開農(nóng)49、鄭農(nóng)花12號、豫花9331和豫花9925遺傳相似系數(shù)為0.9。豫花9331與濮花33和豫花9925 遺傳相似系數(shù)為0.9。濮花28與開17-60和商研9958遺傳相似系數(shù)為0.9。開17-70與開農(nóng)0306和鄭農(nóng)花12號遺傳相似系數(shù)為0.9。駐花1號與濮花33遺傳相似系數(shù)為0.9。豫花9327與鄭農(nóng)花12號和豫花9925遺傳相似系數(shù)為0.9。豫花9925與漯花4087遺傳相似系數(shù)為0.9。鄭農(nóng)花13號與開農(nóng)064遺傳相似系數(shù)為0.9。商花5號與豫花25號和豫花9719 遺傳相似系數(shù)為0.9。豫航花3號與豫花9840遺傳相似系數(shù)為0.9。商研9558 與開17-60遺傳相似系數(shù)為0.9。濮花39與金果1號遺傳相似系數(shù)為0.9。說明這些品種(系)間也具有較高的相似性。

遺傳相似系數(shù)為0的組合有374個。分別為：開農(nóng)012 與其他44個材料間遺傳相似系數(shù)為0。開19-2與其他40個材料間遺傳相似系數(shù)為0。商花10號與其他40個材料間遺傳相似系數(shù)為0。濮花3號與其他37個材料間遺傳相似系數(shù)為0。商花511與其他34個材料間遺傳相似系數(shù)為0。商花8號與其他34個材料間遺傳相似系數(shù)為0。鄭花6號與其他32個材料間遺傳相似系數(shù)為0。鄭農(nóng)花15號與其他22個材料間遺傳相似系數(shù)為0。遠雜9102與其他21個材料間遺傳相似系數(shù)為0。濮花41與其他17個材料間遺傳相似系數(shù)為0。0628-4與其他15個材料間遺傳相似系數(shù)為0。豫花9326與其他14個材料間遺傳相似系數(shù)為0。豫花15號與其他10個材料間遺傳相似系數(shù)為0。在實驗分析的1770個關(guān)系組合中，有616個遺傳相似系數(shù)大于0.5，說明這些品種(系)間具有較低的遺傳相似性。

表2 60個花生品種(系)間的遺傳相似系數(shù)

表2 60個花生品種(系)間的遺傳相似系數(shù) (續(xù)表)

圖 1 各個品種(系)SSR標記聚類圖 Fig. 1 Cluster analysis of peanut genotypes from SSR markers

2.3 聚類分析

圖1可看出，在距離320處，60份花生品種(系)被分成了5大類群，其中第一大類群又分為兩大亞類，亞類I和亞類II各包含16個品種，亞類I中，包含有鄭州7個，分別為：鄭農(nóng)花 12號、豫花22號、遠雜9805、鄭農(nóng)花9號、豫花9925、豫花23號和豫花9327；濮陽2個，分別為：濮花33 和圣濮花1號；開封4個，分別為：開農(nóng)07-24，開農(nóng)0306，開17-60和開農(nóng)49；漯河3個，分別為：漯花4087，漯花1號和漯花8號。亞類II中，包含有鄭州9個，分別為：遠雜9847、鄭農(nóng)花13號、豫花25號、黑花生1101、金果1號、鄭農(nóng)花14號、遠雜9102、豫航花1號和豫花9830；濮陽3個，分別為：濮花35、濮花40和濮東花1號；開封1個，為開農(nóng)064；商丘2個，分別為：商花6號和商花5號；駐馬店1個，為駐花2號。第二大類群包含8個品種，其中鄭州5個，分別為：遠雜9807、1004新品系、豫花9719、豫花9840和豫航花3號；開封1個，為開農(nóng)004；漯河1個，為漯花4016；商丘1個，為商研9958。第三大類群包含8個品種，其中鄭州2個，分別為鄭農(nóng)花7號和豫花聚類獲得的五大類群中，第一類群品種最多，為32個，第四類群品種最少，為3個。鄭州育成的品種(系)在五類中均有出現(xiàn)。開封育成的品種(系)在四大類群出現(xiàn)，且第一類的I、II亞類中都有。商丘育成的品種(系)也分別出現(xiàn)在四大類群中，但在第一類群中，僅出現(xiàn)在第II亞類中。來源于濮陽的品種(系)出現(xiàn)在三大類群中，但第一類群的I、II亞類都有。來源于漯河的品種(系)，出現(xiàn)在三大類群中，但在第一類群中，僅出現(xiàn)在第I亞類中。來源于駐馬店的品種(系)，僅出現(xiàn)在兩大類群中，且第一類群僅在第II亞類中出現(xiàn)。

3 討 論

本研究選用河南省鄭州、濮陽、開封、漯河、商丘、駐馬店等6個地方相關(guān)育種單位選育的近年來正在推廣種植或正在培育的60個花生品種(系)進行SSR標記分析，遺傳相似系數(shù)分析表明，平均值為0.3，在實驗分析的1770個關(guān)系組合中，僅有616個組合的遺傳相似系數(shù)大于0.5，說明這60個品種(系)整體遺傳背景差異較大，這與前人研究表明的花生資源遺傳基礎(chǔ)較窄[2-4]有一定差異?？赡艿脑驗椋阂皇潜狙芯窟x用的材料多數(shù)是不同育種單位近年來收集或者培育的材料，由于目前不同育種單位加強種質(zhì)交流的力度較大，甚至有國外不同類型資源的引入與馴化，以及新種質(zhì)創(chuàng)制的手段也多樣化，例如理化誘變、遠緣雜交等手段的使用，使得新的花生品種(系)有相對較寬的遺傳基礎(chǔ)[7-10]。

二是由于本研究選用的SSR引物為前人研究[12]已經(jīng)證明有較好多態(tài)性的引物，對不同品種(系)的區(qū)分較為明顯。遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果也表明，開19-2與商花10號和開農(nóng)012相似系數(shù)為1，具有較高的相似性。此外，還有30個組合的遺傳相似系數(shù)達到0.9，因而，在創(chuàng)造新材料，組配雜交組合時，可以結(jié)合具體的農(nóng)藝性狀。參考上述結(jié)論，應(yīng)盡量回避在遺傳相似系數(shù)高的組合中進一步組配選育新材料。

在374個遺傳相似系數(shù)為0的組合中，開農(nóng)012、開19-2和商花10號與其他品種(系)的相似系數(shù)則較普遍較低，而這三個品種(系)間卻具有極高的遺傳相似性，說明這三個品種的遺傳背景比較獨特，可能其祖先為共有親本，但與其他資源材料又存在較大差異。在后期新雜交組合選配及資源利用中，應(yīng)充分考慮這三個品種的特性，與其他資源組配合適的組合，培育新的優(yōu)異品種。

聚類分析將60個品種(系)分成了5大類群，這五大類群中，均含有來源于鄭州的品種。不同地方的品種對五大類群的覆蓋度依次為開封、商丘、濮陽、漯河、駐馬店。來源于駐馬店的品種僅在第一大類群的第II亞類和第三大類群中出現(xiàn)。這種現(xiàn)象與本研究選用的材料數(shù)量有關(guān)，鄭州為28個，開封、濮陽分別為9個，商丘為7個，漯河為5個，駐馬店為2個。也與不同地方的花生育種科研人員的數(shù)量與科研實力有關(guān)，不同地方有一定的差異。在第四類群僅有的三個品種中，商丘的品種占了兩個，鄭州占一個。濮陽的9個品種中，在第二類群和第四類群中沒有出現(xiàn)。這些也表明不同的育種單位在培育品種的時候親本來源途徑不盡相同，各有特色。

聚類得到的結(jié)果與遺傳相似系數(shù)分析的結(jié)果有一定的相似性，例如，遠雜9807與漯花4016遺傳相似系數(shù)為0.9，聚類圖上也距離最近。鄭農(nóng)花12號、漯花4087、豫花9925和開農(nóng)49遺傳相似系數(shù)為0.9，聚類同在第一類群第I亞類。豫花9840與豫航花3號遺傳相似系數(shù)為0.9，聚類圖上也距離最近。開19-2與開農(nóng)012遺傳相似系數(shù)為1，聚類圖上也距離最近。

SSR標記是區(qū)分不同花生品種的重要手段[13-22]。在本研究中，所用的多態(tài)性較好的200對SSR引物，能夠基本反映供試品種的多態(tài)性。此外，SSR標記TC3A12在鄭農(nóng)花13號與遠雜9847和豫花9830這三個品種的擴增產(chǎn)物帶型相同，而這三個品種均為高油品種，已有研究也表明此標記與一個高油的QTL位點緊密連鎖，且該QTL對花生油分含量的遺傳貢獻率為2.89%[23]，這也為新品種利用和高油分含量的分子標記輔助選擇育種提供了參考,但這一位點更廣泛的驗證工作還有待進一步開展。而基于這些多態(tài)性SSR標記開展的遺傳多樣性分析，對60個河南省地方花生品種的遺傳多樣性水平有了詳細的了解。在育種工作中，可以結(jié)合農(nóng)藝性狀，利用親緣關(guān)系較遠、遺傳差異大的材料作親本選育優(yōu)良品種。