一種快速高效提取花生葉片DNA的簡(jiǎn)化方法

劉 宇，李春娟，閆彩霞，趙小波，孔 青，孫全喜，苑翠玲，王 娟*，單世華*

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000； 2. 山東省花生研究所，山東 青島 266100)

花生(ArachishypogaeaL.)隸屬豆科(Leguminosaesp.)蝶形花亞科(Papilionoideae)花生屬(Arachis)，是世界上最重要的油料作物之一[1]。同時(shí)，花生種子富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，也是維生素和礦物質(zhì)的良好來(lái)源[2]。大量研究者期望通過(guò)分子改良育種的方式獲得高蛋白、高油酸和高抗性的花生品種。分子標(biāo)記與輔助選擇技術(shù)以基因組測(cè)序?yàn)橹匾獏⒖?https://peanutbase.org/)，該技術(shù)可大大縮短育種周期，提高花生的育種效率[3]。而獲得高質(zhì)量的基因組DNA是相關(guān)研究開(kāi)展的第一步，但是花生組織材料中的蛋白質(zhì)、多糖、多酚物質(zhì)以及其他次生代謝產(chǎn)物等給DNA的提取和純化造成很大的阻礙。此外，下一代測(cè)序技術(shù)(Next Generation Sequencing, NGS)對(duì)DNA的質(zhì)量有了更高的要求，傳統(tǒng)的DNA提取方法SDS法與CTAB法提取花生葉片基因組DNA的濃度和純度尚不能滿足目前高通量測(cè)序的要求。另外，植物DNA提取試劑盒價(jià)格較高且普通存在提取總量較低的狀況。因此，本研究旨在CTAB法基礎(chǔ)上優(yōu)化出一套成本低，耗時(shí)短的簡(jiǎn)化方法，并且能夠適用于高通量測(cè)序的高質(zhì)量DNA，為花生分子育種與篩選的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究隨機(jī)選用4個(gè)花生品種(表1)。每個(gè)品種選取2～4粒完整飽滿種子，于培養(yǎng)皿中避光浸種3～4 d，待芽長(zhǎng)至2～4 cm后置入培養(yǎng)盒，光照培養(yǎng)箱(溫度：25 ℃；光照強(qiáng)度：12000 lx)培養(yǎng)10～13 d。實(shí)驗(yàn)時(shí)取第三對(duì)真葉。

表1 四份DNA提取花生品種信息

1.2 DNA提取

1.2.1 快速提取花生葉片DNA改良步驟如下：

(1) 稱(chēng)取50 mg花生幼嫩葉片，置于1.5 mL離心管中，將離心管中下部浸入液氮，取出離心管后用已燒制成球狀且預(yù)冷的200 μL槍頭(液氮中浸泡4～5 s)快速研磨。

(2) 加入650μL預(yù)熱的CTAB，加入RNase A酶6.5μL，渦旋振蕩30s，顛倒混勻后，迅速放入65℃水浴鍋中孵育30min。每10min顛倒混勻一次。

(3) 從水浴鍋中取出樣品管，加入650 μL預(yù)冷的酚-氯仿(25∶24)，蓋好管蓋后緩慢上下顛倒搖動(dòng)5～10 min。10000 r/min下離心10 min。重復(fù)本步驟一次。

(4) 用移液槍緩慢吸取上層清液650～700 μL至1.5 mL離心管中。

(5) 在獲得的上清液中沿管壁緩慢加入預(yù)冷的異丙醇500 μL，可觀察到接觸面有沉淀層產(chǎn)生。

(6) 快速吸去上層與下層液體，將中間沉淀層轉(zhuǎn)移至新的離心管當(dāng)中。

(7) 加入600 μL 70%乙醇600 μL洗滌沉淀，振蕩數(shù)秒鐘，5000 r/min條件下離心1 min去上清液。重復(fù)本步驟一次。

(8) 室溫下干燥DNA沉淀，當(dāng)有無(wú)色膠狀物附在管壁時(shí)，加入70 μL TE緩沖溶液(Tris-EDTA buffer solution)溶解沉淀的DNA。

1.2.2 CTAB法花生葉片DNA提取步驟

用常規(guī)CTAB法[4]提取DNA。

1.3 DNA檢測(cè)方法

1.3.1 總DNA電泳檢測(cè)

以DL 15000 DNA Marker(TaKaRa, Dalian)為標(biāo)記， 取DNA溶液2 μL與適量6×Loading Buffer(TaKaRa, Dalian)混勻，點(diǎn)入含有Super GelRed(US EVERBRIGHT, Suzhou)的1% DNA瓊脂糖(US EVERBRIGHT, Suzhou)凝膠中，1×TAE緩沖液電泳，于凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon 2500R, Shanghai)獲取圖像。

1.3.2 DNA濃度和純度檢測(cè)

取1 μL DNA提取液于Nanodrop-超微量分光光度計(jì)(Pultton P100/P100+，Shanghai)樣品室中，檢測(cè)其相對(duì)濃度以及根據(jù)OD260/OD280、OD260/OD230值確定DNA的純度，每個(gè)樣品檢測(cè)三次，求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法DNA提取時(shí)間比較

使用花生葉片DNA簡(jiǎn)化提取法完成四個(gè)花生葉片的 DNA 提取共用時(shí)約1h 15min，而使用CTAB 法完成相同規(guī)模DNA 提取則需要 3 h左右，時(shí)間縮短一半以上。

2.2 不同提取方法對(duì)DNA完整性的影響

從CTAB 法提取的花生葉片總 DNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳圖(圖1 A)可見(jiàn)，該法提取的花生葉片DNA的條帶都有拖尾，帶型不整齊，說(shuō)明DNA已有部分降解，DNA完整性較差；此外，點(diǎn)樣孔中有白亮物質(zhì)，說(shuō)明樣品DNA中殘留有少量的多糖、蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)[5]。

圖1 花生葉片總DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from peanut leaves 注： A:CTAB法 CTAB method; B:提取簡(jiǎn)化法 Simplified method

表2 兩種方法提取花生葉片的總DNA 質(zhì)量比較

注： 表中濃度及純度值均為三個(gè)重復(fù)樣品的平均值。

Note: All DNA concentration and purity data is the average value from three repeats

從DNA簡(jiǎn)化法提取的花生葉片總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖 (圖 1 B)可見(jiàn)，花生葉片DNA的條帶清晰單一，帶型整齊，點(diǎn)樣孔中未發(fā)現(xiàn)有白亮物質(zhì)，說(shuō)明獲得的DNA完整性好、未發(fā)生降解。由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)DNA簡(jiǎn)化方法提取的DNA完整性顯著提高，且未發(fā)現(xiàn)殘留的酚類(lèi)物質(zhì)、蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)，DNA提取效果顯著增加。

2.3 不同提取方法對(duì)DNA純度與產(chǎn)量的影響

OD260與OD280的比值通常用于DNA純度的判定。OD260/OD280>2.0表示有RNA污染，OD260/OD280<1.6表示有蛋白質(zhì)污染，OD260/OD280為1.6～2.0時(shí)，表明DNA純度較高[6]。

表2可知，CTAB法提取DNA的OD260/OD280值范圍為1.372～2.370，其中樣品1與樣品3的OD260/OD280值<1.6，表明樣品DNA中的蛋白質(zhì)未除盡；樣品2與樣品4的OD260/OD280值>2.0，表明樣品出現(xiàn)RNA污染；OD260/OD230值為1.469～1.958，表明樣品DNA中出現(xiàn)酚類(lèi)物質(zhì)污染；每0.1 g花生嫩葉可提取約13 μg DNA。DNA簡(jiǎn)化法提取DNA的OD260/OD280值一般為1.7～2.0，表明提取的樣品DNA中蛋白質(zhì)含量都較低；同時(shí)，OD260/OD230值一般為2.0～3.0，表明樣品中基本沒(méi)有酚類(lèi)物質(zhì)污染；每0.1 g花生嫩葉可提取約16 μg DNA。

簡(jiǎn)化法提取的DNA樣品中RNA、蛋白質(zhì)、酚類(lèi)等物質(zhì)含量較低，OD260/OD280、OD260/OD230值比較理想，DNA質(zhì)量較高，且與CTAB法相比，單位質(zhì)量花生葉片提取的DNA產(chǎn)量較高。DNA提取簡(jiǎn)化法DNA提取質(zhì)量明顯優(yōu)于CTAB法。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，以植物DNA為基礎(chǔ)的分子克隆等分子生物技術(shù)、DNA標(biāo)記分析以及基因組重測(cè)序的研究不斷深入，獲取高質(zhì)量的DNA成為相關(guān)研究的重要前提。然而花生DNA中往往會(huì)蘊(yùn)含豐富的RNA、蛋白質(zhì)、多酚類(lèi)物質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行[7-8]。因此，開(kāi)發(fā)一種更快捷、更高效的DNA提取方法是必要的。周賢達(dá)[9]等為解決田間西瓜葉片提取 DNA 雜質(zhì)較多及逐個(gè)樣品提取效率低的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)了一種基于96孔PCR板的西瓜葉片DNA快速提取方法，提取的 DNA濃度為287～573 ng·μL-1，并且DNA提取液中含有較少的蛋白質(zhì)、酚類(lèi)及小分子雜質(zhì)。丁浩[10]等在CTAB裂解后直接添加RNase A，然后再經(jīng)過(guò)一系列的抽提、沉淀、洗滌，獲得高質(zhì)量的DNA，減少了RNA的污染。陳林楊[11]等在裂解細(xì)胞之前，向磨碎的植物材料中加入干擾物清除液，去除植物材料中干擾DNA提取的代謝物，并在后續(xù)步驟中進(jìn)行了一些優(yōu)化，并且該法應(yīng)用于CTAB法和Plant DNA Mini Kit試劑盒時(shí)DNA的質(zhì)量均獲得提升。此外，使用高鹽TE緩沖液(1.0～2.5 mol/L NaCl)、DNA沉淀前乙醚和NaCl 以及細(xì)胞核裂解之前去除細(xì)胞質(zhì)中的雜質(zhì)等改良方法，可有效地減少多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)污染，提高DNA提取質(zhì)量[12-14]。

本研究基于傳統(tǒng)的CTAB法，對(duì)提取花生葉片DNA進(jìn)行如下改進(jìn)：① 以燒制成圓球狀的槍頭與離心管的一體研磨裝置代替了傳統(tǒng)的研缽研磨裝置；② 在水浴裂解細(xì)胞之前加入RNase A；③ 加入異丙醇后，在DNA沉淀時(shí)將其迅速分離。與傳統(tǒng)的CTAB法相比，其優(yōu)越之處在于在保證高質(zhì)量的前提下，操作簡(jiǎn)單易行，時(shí)間短，成本低。在樣品預(yù)處理階段，直接使用酒精燈燒制成球狀的槍頭在離心管中研磨葉片節(jié)省了從研缽向離心管中轉(zhuǎn)移葉片組織的時(shí)間，減少了葉片組織的浪費(fèi)，相同質(zhì)量的葉片組織可獲得較多的DNA產(chǎn)量，同時(shí)免去了滅菌、清洗研缽的繁瑣工作。

此外，與使用自動(dòng)化樣品研磨儀器相比，降低了花生葉片DNA的提取成本；另外，在DNA沉淀階段，在低溫放置的異丙醇加入離心管時(shí)，接觸面會(huì)產(chǎn)生絮狀DNA沉淀，迅速將沉淀分離，可減少多糖、蛋白質(zhì)、多酚類(lèi)等物質(zhì)的含量，從而提高DNA的質(zhì)量與純度，同時(shí)也減少了DNA沉淀時(shí)所用的時(shí)間。提取同樣規(guī)模的組織樣品，改進(jìn)法可以節(jié)省約二分之一的時(shí)間，并且其提取DNA的質(zhì)量、純度以及產(chǎn)量均優(yōu)于傳統(tǒng)CTAB法。此外，該改進(jìn)方法在PlantZol試劑盒(TRAN，北京)提取的DNA質(zhì)量也得到相應(yīng)提升。該方法可作為一種快速高效的花生葉片DNA提取的簡(jiǎn)易方法，適用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和高通量測(cè)序等后續(xù)研究。