新造地馬鈴薯根際固氮解磷微生物的分離與鑒定

王惟帥，楊世琦，楊正禮

(1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081；2 農(nóng)業(yè)部 農(nóng)業(yè)環(huán)境與氣候變化重點開放實驗室，北京 100081)

延安屬黃河中游丘陵溝壑區(qū)，土壤母質(zhì)疏松，植被覆蓋率低，由于長期的不合理開發(fā)利用，導(dǎo)致土質(zhì)退化、水土流失等問題[1]。自退耕還林、還草措施實施以來，該區(qū)域植被覆蓋面積明顯提高，然而，退耕過度又導(dǎo)致退耕規(guī)模超過了人均耕地需求下限，出現(xiàn)了人口與耕地不平衡的局面[2]。為緩解這一矛盾，延安政府大力開展治溝造地，但在使用機械化里切外墊等方法使新造地面積增長的同時，又致使熟土被壓、土壤結(jié)構(gòu)遭到破壞；并且研究發(fā)現(xiàn)，新造地農(nóng)田土壤氮和磷含量、土壤酶活性、微生物豐度等均較低[3-4]。

氮、磷作為植物生長必需的營養(yǎng)元素，對作物生長具有重要作用，但一般農(nóng)田土壤中氮、磷的有效供應(yīng)量很少，通常通過施肥來滿足作物生長的需要。然而研究表明，化肥施用量的增加會導(dǎo)致化肥利用率降低；同時，化肥會污染空氣、土壤及水體，破壞土壤結(jié)構(gòu)和微生物多樣性，還會降低農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等[5]。因此，利用土著微生物進行固氮解磷，不僅在為作物提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時減少了化肥施用量，而且還可以提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)，調(diào)節(jié)作物生長，改良土壤環(huán)境等[6-10]。

馬鈴薯是延安地區(qū)主要的糧食作物之一，能夠適應(yīng)新造地土壤類型，隨著種植面積的不斷擴大，其已成為該地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要推動力，在提升糧食產(chǎn)量和增加農(nóng)民收入方面起到積極作用[11]。因此，本研究從新造地馬鈴薯根際土壤中分離固氮解磷微生物，并從中篩選固氮解磷特性較好的有益功能菌株，以期為延安新造地馬鈴薯微生物菌肥的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品來源與處理 土壤樣品采自延安市安塞區(qū)南溝村(109°12′12″-109°22′12″ E，36°41′24″-36°46′12″ N)，海拔1 219 m，年降水量500～550 mm；土壤以黃綿土為主，質(zhì)地為粉沙，抗侵蝕能力差。采用蛇型采樣法，選15個采樣點，每個采樣點取馬鈴薯根際土壤樣品500 g，混勻后，采用四分法留取約1 000 g土樣，將土樣保留于自封袋中并運回實驗室以分離固氮解磷菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)Ashby無氮培養(yǎng)基。甘露醇10 g，KH2PO40.2 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.2 g，K2SO40.3 g，CaCO35 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃ 滅菌30 min。

(2)無機磷培養(yǎng)基。NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，(NH4)2SO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003 g，MnSO4·4H2O 0.003 g，Ca3(PO4)25.0 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5，121 ℃ 滅菌30 min；

(3)LB培養(yǎng)基。蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

1.2 固氮解磷菌的分離與純化

稱取10 g新鮮土壤樣品，置于250 mL三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，30 ℃、150 r/min振蕩40 min，靜置后得到懸浮液。采用稀釋法[12]將該懸浮液稀釋至不同濃度，取0.1 mL稀釋液均勻涂布在Ashby無氮培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，選擇不同類型的單個菌落，經(jīng)平板多次純化，純化后的菌落接種于無機磷培養(yǎng)基中，通過溶菌圈法[13]篩選固氮解磷菌，純化得到的菌株保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3 固氮解磷菌的形態(tài)觀察與鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)特征 將篩選出來的菌株劃線接種至LB平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其在平板上的菌落生長狀況、顏色、透明度、濕潤度、光滑度等[12]。

1.3.2 16S rDNA序列分析 利用SDS-CTAB法[14]提取各菌株基因組總DNA，采用細菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-

TT-3′)進行16S rDNA的PCR擴增，擴增片段長度為1.5 kb。PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL，上、下游引物(50 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA(40 ng/μL) 0.5 μL，TaqDNA聚合酶(3 U/μL) 0.5 μL，無菌ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，送北京君諾德生物技術(shù)有限公司測序。將獲得的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，BLAST搜索同源序列，采用MEGA 5.0軟件，以Neighbor-joining法[14]建立固氮解磷菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 固氮解磷菌固氮解磷能力的測定

1.4.1 固氮能力測定 采用乙炔還原法[12]測定固氮解磷菌的固氮能力。挑取LB斜面培養(yǎng)基上的單菌落接種到Ashby無氮培養(yǎng)基上，28 ℃活化；選擇長勢良好的菌株，挑取菌落大小相近的單菌落接種于裝有6 mL Ashby液體培養(yǎng)基的西林瓶中，西林瓶體積為10 mL，壓蓋密封，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。在無菌條件下將體積分數(shù)10%的空氣抽出，注入體積分數(shù)10%的高純乙炔。30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，用氣相色譜儀測定乙烯的生成量。按以下公式計算其固氮酶活性：

ARA=(Vst×Cst×Asa×Vtu)/(Vsa×Ast×H×22.4)。

式中：ARA為固氮酶活性，nmol/h；Vst為標(biāo)準(zhǔn)乙烯進樣體積，mL；Cst為標(biāo)準(zhǔn)乙烯濃度，nmol/mL；Asa為乙烯峰面積,cm2；Vtu為西林瓶體積，mL；Vsa表示樣品進樣體積，mL；Ast表示標(biāo)準(zhǔn)乙烯峰面積,cm2；H表示培養(yǎng)時間，h。

1.4.2 解磷能力測定 (1)將分離純化得到的固氮解磷菌接轉(zhuǎn)到無機磷固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑(d)和透明圈直徑(D)，用D/d值表征其溶磷能力，值越大表示溶磷能力越強[13]。(2)將供試菌株接種于已滅過菌的裝有30 mL無機磷液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1，3，5，7 d時取樣，將樣液4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液采用鉬藍比色法[9]測定有效磷含量。設(shè)不接種菌株為空白對照(CK)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)整理和制圖，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和差異顯著性檢驗，采用MEGA 5.0軟件建立固氮解磷菌16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮解磷菌的分離及其形態(tài)學(xué)特征

通過土壤懸浮液富集培養(yǎng)并進行梯度稀釋培養(yǎng)純化后，觀察菌落形態(tài)的差異，從土樣中共分離出具有固氮活性的菌株37株，將這37株菌株分別接種到無機磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過溶菌圈確定具有解磷功能的菌株，進一步利用固氮解磷交叉試驗最終篩選得到9株菌株，其皆具有固氮解磷功能，且菌株生長良好，各菌株的菌落形態(tài)及生長狀況如表1和圖1所示。

表1 從馬鈴薯根際分離的9株固氮解磷菌的生長狀況和菌落形態(tài)Table 1 Growth and colonial morphology of 9 nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria isolated from potato rhizosphere

注：“++++”代表長勢旺盛(菌落濃、厚、密)，“+++”代表長勢良好(滿足菌落濃、厚、密中的兩條)。

Notes:“++++” means growing vigorously(Dense,thick and numerous colony),“+++” means growing well(Meeting the above two).

圖1 從馬鈴薯根際分離的9株固氮解磷菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of 9 nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria isolated from potato rhizosphere

2.2 固氮解磷菌的16S rDNA序列同源性分析

將9株固氮解磷菌的16S rDNA 基因測序后輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結(jié)果(表2)顯示，9株菌分屬于不同的菌屬，其中與N31基因相似性最高的菌株為假單胞菌PseudomonasaeruginosaGBAP5(100%)，菌株N33與克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeCRKP-1215的基因相似性最高(100%)，N34與紅球菌RhodococcuserythropolisHX-2(100%)相似性最高，N46與節(jié)桿菌PaenarthrobacternitroguajacolicusBF-R19相似性最高(100%)，P33與芽孢桿菌BacillussafensisXQ56的基因相似度最高(100%)； P34與貪噬菌Variovoraxsp.553相似度最高(99%)，P52與腸桿菌KosakoniacowaniiP4菌株的基因相似度最高(99%)，OP1與副球菌Paracoccussp. ENF1相似度最高(99%)，OP8與芽孢桿菌BacillusaryabhattaiFORT25相似度最高(99%)。

采用鄰接法構(gòu)建9株固氮解磷菌及其最高相似性菌株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)進化發(fā)育樹，結(jié)果(圖2)顯示，9株固氮解磷菌與其16S rDNA基因序列最高相似性菌株位于同一分支，說明它們具有高度的同源性。

綜上所述，本試驗從延安新造地馬鈴薯根際土壤分離得到9株具有固氮解磷功效的菌株，分別歸屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、節(jié)桿菌屬(Paenarthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、貪噬菌屬(Variovorax)、腸桿菌屬(Kosakonia)和副球菌屬(Paracoccus)，其中菌株P(guān)33和OP8均屬于芽孢桿菌屬。

表2 從馬鈴薯根際分離的9株固氮解磷菌的鑒定結(jié)果Table 2 Identification of 9 nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria isolated from potato rhizosphere

2.3 固氮解磷菌的固氮酶活性

圖3顯示，通過篩選得到的9株菌均具有固氮功能，固氮酶活性為11.88～95.08 nmol/h，且各菌株的固氮酶活性存在差異，其中菌株N34的固氮酶活性最高，達到95.08 nmol/h，是菌株N31的8倍；N46的固氮酶活性次之，為75.58 nmol/h，且菌株N34和N46的固氮酶活性與其他菌株差異顯著；菌株N31與OP8的固氮酶活性相當(dāng)，N33、P33、P52和OP1 之間的固氮能力均沒有顯著差異。

2.4 固氮解磷菌的溶磷特性

圖4表明，9株菌在無機磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，其D/d(透明圈直徑/菌落直徑)值為1.12～1.87，其中菌株N46的D/d值最大，且與其他菌株的溶磷能力差異顯著；N34與OP8的溶磷能力相當(dāng)，其余各菌株間的溶磷能力均無顯著差異。這說明9株固氮解磷菌均具有溶解不溶性磷的能力，且菌株之間存在差異。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same below
圖3 從馬鈴薯根際分離的9株固氮解磷菌的固氮酶活性
Fig.3 Nitrogenase activity of 9 nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria isolated from potato rhizosphere

“D/d”表示“透明圈直徑/菌落直徑”“D/d” means “transparent circle diameter/colony diameter”
圖4 從馬鈴薯根際分離的9株固氮解磷菌的溶磷能力
Fig.4 Phosphate solubilizing ability of 9 nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria isolated from potato rhizosphere

采用鉬藍比色法[9]對9株菌的溶磷能力進行定量測定，結(jié)果(圖5)表明，9株菌7 d內(nèi)的溶磷量呈持續(xù)上升趨勢，其中菌株N46的溶磷能力最好，7 d的累積有效磷含量達到54.9 mg/L，與其他菌種差異顯著；菌株N34與OP8的溶磷能力相當(dāng)，累積有效磷含量達到48 mg/L；N33、P33和OP1的溶磷能力基本一致，累積有效磷含量超過37 mg/L；與其他菌種相比，菌株N31和P34的溶磷能力較差。

圖5 從馬鈴薯根際分離的9株固氮解磷菌的有效磷含量Fig.5 Phosphorus solubilization capacity of 9 nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria isolated from potato rhizosphere

3 討 論

已有研究發(fā)現(xiàn)，從小麥、玉米、馬鈴薯等作物根際分離的固氮菌中，芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬和假單胞桿菌屬為農(nóng)作物和經(jīng)濟作物根際常見的功能菌[15-18]。牛艷芳等[19]在白樺根際土壤中分離得到固氮菌的不同類群，并通過解磷試驗發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌屬和節(jié)桿菌屬的微生物具備解磷特性。李瓊潔等[20]從玉米根際分離得到一株具有較高固氮活性的菌株，該菌株還具有較好的泌銨能力，經(jīng)鑒定，該菌株屬于腸桿菌屬。張磊[21]從馬鈴薯根際分離得到固氮菌，經(jīng)鑒定為節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬等優(yōu)勢種群，且具有良好的解磷功能。姜瑛等[12]從灰潮土中分離得到一株固氮菌，經(jīng)固氮解磷試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強的固氮解磷功能，且可以促進花生對營養(yǎng)元素的吸收，經(jīng)鑒定該菌株屬于貪噬菌屬。門惠芹等[22]從枸杞根際分離純化得到固氮菌，且通過試驗驗證接種該菌株可以促進植株的生長，鑒定發(fā)現(xiàn)該菌株為紅球菌屬。本研究從延安新造地馬鈴薯根際土壤中分離得到9株固氮解磷菌，經(jīng)16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定其屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、節(jié)桿菌屬(Paenarthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、貪噬菌屬(Variovorax)、腸桿菌屬(Kosakonia)和副球菌屬(Paracoccus)。

固氮解磷菌在土壤中會直接或間接影響土壤肥力和地上作物的生長，在豐富土壤微生物多樣性的同時，對土壤修復(fù)和作物生長起到積極的促進作用。此外，固氮解磷菌固定的氮素除供自身生長發(fā)育外，部分以無機狀態(tài)或簡單的有機氮化物分泌到體外；同時，固氮解磷微生物通過分泌有機酸、質(zhì)子和多糖等溶解不溶性磷，以供植物吸收利用，從而減少化肥的使用量，功能菌的這種特性使其在生產(chǎn)應(yīng)用中具有重要意義[23]。

在自然狀態(tài)下，馬鈴薯根際也會存在固氮解磷菌，但與龐大的根際微生物系統(tǒng)相比，固氮解磷菌的種群數(shù)量相對較少，固氮量也很小；同時，新造地土壤微生物數(shù)量少，生物活性低，土壤肥力和土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，對這類土壤進行修復(fù)的最佳方式就是施用菌劑，輸入活性微生物。研究表明，將高效功能菌劑應(yīng)用于生荒地后，土壤生物活性得以顯著改善，對于修復(fù)生荒地土壤生態(tài)具有重要意義[24-26]。本研究中分離篩選的固氮解磷微生物，種類豐富，打破了傳統(tǒng)菌肥菌種單一的現(xiàn)狀，9株菌種除具有固氮活性外，還具有溶磷功能，對于開發(fā)專用固氮解磷菌肥具有重大意義。通過此種方式篩選出的菌種，與特定作物根系互作性好，對當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境的適應(yīng)性也更強，將分離出的固氮解磷微生物以回接的方式施于土壤中，可以達到增產(chǎn)和改善土壤環(huán)境的效果。

4 結(jié) 論

本研究從延安新造地馬鈴薯根際土壤中分離純化得到9株固氮解磷菌，均具有固氮和解磷功能，其中固氮能力最好的菌株為N34，固氮酶活性為95.08 nmol/h；解磷能力最好的菌株為N46，7 d累計溶磷量達到54.9 mg/L。