不同進口藍耳病病原抗體ELISA檢測試劑盒比較及應(yīng)用淺析

李乃果 賈松濤

（1河南省滎陽市畜牧局，河南滎陽 450100；2河南省鄭州市動物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450052）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起豬的一種高度接觸性傳染病，其主要特征是引起母豬繁殖障礙及仔豬呼吸道癥狀。1987年P(guān)RRS在北美首次暴發(fā)，1996年P(guān)RRS在我國大陸地區(qū)流行，2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（Highly pathogenic PRRS,HP-PRRS）在我國暴發(fā)。近年來，PRRS類NADC30新毒株在我國流行，成為優(yōu)勢流行毒株之一。感染母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙，如發(fā)情不典型、受孕率低、流產(chǎn)、難產(chǎn)、木乃伊胎、弱仔及死胎等癥狀?；疾∽胸i主要表現(xiàn)出呼吸道疾病，咳喘、被毛粗亂、生長緩慢及死亡率增加。PRRSV感染豬常導(dǎo)致機體免疫抑制，使機體易受環(huán)境和條件性病原的影響，伴隨其他疾病發(fā)生，如與豬支原體病、副豬嗜血桿菌病、豬流感及仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬呼吸道病綜合征等疾病混合感染、多重感染。PRRS是對中國養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失的豬病之一。早期監(jiān)測和防控PRRS，對控制PRRS在豬場的穩(wěn)定尤為重要。

目前，市場上銷售的檢測PRRS抗體的試劑盒有多種，尤其是進口試劑盒在國內(nèi)市場上有多個商業(yè)品牌，實驗室或者養(yǎng)殖場在選擇檢測試劑盒的時候往往無所適從。

筆者選購了市場上占有率較高的4種PRRS抗體檢測試劑盒，并篩選出其中1種敏感度較高、符合豬場臨床生產(chǎn)要求的試劑盒，以期為其他實驗室或者養(yǎng)殖場科學(xué)合理選擇PRRS抗體檢測試劑盒提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

PRRS病原陰/陽性血清，由河南天馳生物科技公司提供。

選擇4種進口PRRS抗體檢測試劑盒，分別由I、J、B、L公司生產(chǎn)。

一次性1.5 mL離心管、精密微量移液器（50～1 000μL）、移液滴頭、微量振蕩器、酶標(biāo)儀、臺式離心機、隔水式培養(yǎng)箱等實驗器材。

1.2 檢驗方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

對于每份待檢血清，分別用上述4種進口PRRS抗體檢測試劑盒檢測，分析其符合率，以此比較各方法差異。檢測及結(jié)果判定均按照說明書方法進行。

I廠家試劑盒以核衣殼蛋白為包被抗原，可以檢測EU/US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是S/P值（樣品OD值/陽性對照平均OD值）≥0.4為陽性，S/P值＜0.4為陰性。J廠家試劑盒以核衣殼蛋白為包被抗原，只能檢測US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是S/P值≥0.4為陽性，S/P值＜0.3為陰性，S/P值介于0.3～0.4之間為可疑。B廠家試劑盒以滅活PRRS EU/US病毒為包被抗原，只能檢測EU或者US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是S/P值≥0.4為陽性，S/P值≤0.399為陰性。L廠家試劑盒包被的是膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5），只能檢測US毒株抗體，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是IRPC 值 ﹝（樣品OD值-陰性對照平均OD值）/（陽性對照平均OD值-陰性對照平均OD 值）﹞ ＞20為陽性，IRPC值≤20為陰性。

2 檢驗結(jié)果

2.1 檢測陽性樣品的試劑盒敏感性比較

取1份已知為PRRSV陽性的樣品，該樣品為PRRS美洲株免疫的高免血清，將陽性樣品用相應(yīng)的樣品稀釋液進行 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀釋，評估I、J、B、L不同廠家試劑盒的檢測敏感性。結(jié)果表明，I廠家試劑盒在樣品進行10-4稀釋后仍然可以檢測到抗體，J和B廠家試劑盒在樣品稀釋后檢測不到抗體，因此，I廠家的敏感性最好（見表1）。

2.2 檢測免疫過PRRS疫苗的血清樣品的試劑盒敏感性比較

取2份已免疫過PRRS疫苗（免疫疫苗為高致病性藍耳病凍干活疫苗，天津株）的血清樣品，分別標(biāo)記為血清樣品1、血清樣品2，將待檢樣品用相應(yīng)的樣品稀釋液進行 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍比稀釋，按照各試劑盒操作要求，檢測血清中的抗體水平，評估不同廠家試劑盒的檢測敏感性。結(jié)果顯示，I廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2分別稀釋10-6和10-7后，仍然可以檢測到樣品抗體陽性；J廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2分別稀釋10-2和10-3后，可以檢測到樣品抗體陽性；B廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2分別稀釋10-2和10-4后，可以檢測到樣品抗體陽性；L廠家的試劑盒在血清樣品1和血清樣品2均是稀釋10-4后，可以檢測到樣品抗體陽性；從稀釋倍數(shù)數(shù)據(jù)比較說明I廠家的試劑盒敏感性最好，J、B、L三個廠家敏感性相當(dāng)（表2）。

3 應(yīng)用PRRS抗體檢測數(shù)據(jù)建立豬場PRRS抗體基準(zhǔn)線

各養(yǎng)豬企業(yè)可以基于長時間的PRRS抗體水平檢測數(shù)據(jù)積累和處理經(jīng)驗建立本企業(yè)的PRRS抗體水平基準(zhǔn)線，也就是所謂的“baseline values”?；鶞?zhǔn)線的建立是一項系統(tǒng)工程，一旦建立了屬于本場的生產(chǎn)基準(zhǔn)線，便可快速評估免疫程序是否合理，有效分析日常檢測數(shù)據(jù)，增強檢測結(jié)果的生產(chǎn)指導(dǎo)意義，避免經(jīng)驗主義，及時判斷整個豬群有無潛在的安全隱患。

如果檢測數(shù)據(jù)偏離基準(zhǔn)線，則提示生產(chǎn)環(huán)境中發(fā)生了某些改變，如感染疾病、免疫失敗等。如果檢測的抗體滴度值遠高于正常的抗體水平，則提示存在野毒感染的可能性；如果檢測的抗體滴度值低于預(yù)期的疫苗免疫應(yīng)答滴度，則表明免疫程序不合理或者疫苗質(zhì)量有問題。但每個豬場的基準(zhǔn)線并不一樣，應(yīng)該結(jié)合本場的實際情況綜合判斷。

基于大量的PRRS抗體檢測數(shù)據(jù)并結(jié)合多數(shù)豬場的飼養(yǎng)管理狀況，總體出PRRS抗體與豬場生產(chǎn)性能存在相關(guān)性：①高性能生產(chǎn)水平、健康且持續(xù)穩(wěn)定的豬場，符合S/P值≥2.0的個體占整個群體的比例≤10%，S/P值≥2.5的個體出現(xiàn)比率低（≤5%）或不出現(xiàn)，種豬群體S/P值介于0.4～1.5之間，群體占比80%～90%；②中等偏上水平、健康穩(wěn)定且偶有波動的豬場，S/P值≥2.0的個體占整個群體的比例≤20%，S/P值≥2.5的個體占整個群體的比例≤10%，S/P值≥3.0的個體不出現(xiàn)或很少出現(xiàn)（≤5%），種豬群體S/P值介于0.4～1.5之間，占70%～80%；③中等性能水平、季度性出現(xiàn)波動的豬場，S/P值≥2.0的個體占整個群體的比例在20%～30%。

表1 陽性樣品試劑盒敏感性檢測結(jié)果

表2 免疫過PRRS疫苗的血清樣品的試劑盒敏感性檢測結(jié)果

4 結(jié)論與分析

⑴通過檢測PRRS抗體水平建立抗體水平基準(zhǔn)線并在實際生產(chǎn)中應(yīng)用是一項積極的探索，并且可以推廣至其他疫病的監(jiān)測上。

⑵通過對樣品進行實驗室血清學(xué)的檢測并對照建立抗體水平基準(zhǔn)線，能夠及早發(fā)現(xiàn)某種疫病免疫程序中可能存在的問題，可以為豬場提供風(fēng)險預(yù)警，便于查找風(fēng)險點并及時進行防控。

⑶豬場PRRS抗體的水平與其保護力不是正相關(guān)的關(guān)系，檢測的PRRS抗體陽性率并不能代表對PRRS的保護力。目前的抗體檢測方法不能區(qū)分PRRSV流行毒株感染產(chǎn)生的抗體和疫苗免疫產(chǎn)生的抗體；檢測的抗體水平一般都是總抗體水平，不代表中和抗體水平。但是抗體陽性率和平均值，可以反映PRRS的穩(wěn)定狀態(tài)，個體動物或者整個豬群的S/P值的走勢能夠反映PRRS感染所處的階段，可用于分析疾病處于感染初期還是轉(zhuǎn)歸階段。