石房蛤毒素膠體金快速檢測試紙卡的應(yīng)用研究

黃奕雯

(福建省漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

赤潮是由于受環(huán)境氣候影響，水域中的浮游植物、原生生物、細菌等暴發(fā)性增殖或聚集而引起水體變異樣的一種有害生態(tài)異?，F(xiàn)象[1]。其不僅會使魚類、貝類等因呼吸困難而死亡，同時有毒赤潮藻的毒素會在貝類等海洋生物體內(nèi)積累并向食物鏈上層傳遞[2]，從而對人類生命健康產(chǎn)生危害。隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，我國近岸海域水體富營養(yǎng)化程度日趨嚴(yán)重，加上特殊的海灣環(huán)境和氣候條件，近年來有毒有害赤潮不斷發(fā)生，嚴(yán)重威脅到漁業(yè)生產(chǎn)安全和民眾身體健康。

麻痹性貝毒(Paralytic shellfish poisoning，PSP)是迄今為止世界范圍內(nèi)分布最廣、危害最大的一類赤潮生物毒素，已成為當(dāng)前海洋科學(xué)的研究熱點，受到廣泛關(guān)注。麻痹性貝毒與河豚毒素作用機理類似，是一種鈉離子(Na+)通道阻滯劑[3]，主要通過阻斷Na+內(nèi)流來抑制細胞動作電位的傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙而產(chǎn)生麻痹作用。中毒表現(xiàn)為食用后0.5 h至3.0 h內(nèi)引起嘴、唇、舌麻木或有刺痛感，產(chǎn)生頭痛、暈眩、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者肌肉麻痹、四肢抽搐、呼吸困難，甚至窒息而亡[4-5]。麻痹性貝毒是一類四氫嘌呤的三環(huán)化合物[6]，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，是由石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)及其天然衍生物組成的胍類毒素，易溶于水，在酸性條件下耐熱[7]。目前已發(fā)現(xiàn)的麻痹性貝類毒素有二十幾種，根據(jù)R4取代基團的差異，可以將其分為四類：氨基甲酸酯類毒素(Carbamate toxins)的R4基團為“-COONH2”，包括石房蛤毒素、新石房蛤毒素、膝溝藻毒素1～4等；N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfocarbamoyl toxins)的R4基團為“-COONHSO3”，包括膝溝藻毒素5～6等；脫氨甲?；惗舅?Decarbamoyl toxins)的R4基團為“-OH”，包括脫氨甲?；扛蚨舅亍⒚摪奔柞；率扛蚨舅氐?；脫氧脫氨甲酰基類毒素(Deoxydecarbamoyl toxins)的R4基團為“-H”，包括脫氧脫氨甲酰基石房蛤毒素、脫氧脫氨甲酰基膝溝藻毒素2～3等[8-9]。其中石房蛤毒素占麻痹性貝毒的85%以上，是主要毒素[10]。我國及國際上多數(shù)國家都以石房蛤毒素為貝類產(chǎn)品中麻痹性貝毒的檢測指標(biāo)，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)均規(guī)定貝類中PSP的限量標(biāo)準(zhǔn)為80 μg STX/100 g[11-12]，即以800 μg/kg STX含量為限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前，我國麻痹性貝毒的檢測方法主要有小鼠生物法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[13]。這些常規(guī)檢測方法主要依托實驗室建立，對儀器設(shè)備、實驗耗材、環(huán)境條件和操作技能等都有較高的要求，需由專業(yè)技術(shù)人員開展相關(guān)檢測，并且大多檢測周期較長、價格昂貴，當(dāng)樣品量大或遇到赤潮應(yīng)急監(jiān)測時，其檢測效率則難以滿足實際工作的需求。因此，建立簡便實用、快速有效、容易推廣的貝類毒素檢測方法顯得尤為重要。膠體金快速檢測技術(shù)是20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的新興免疫層析檢測技術(shù)，其利用抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)和層析反應(yīng)原理，以干片法試紙的形式，將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，用膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，應(yīng)用微孔膜的毛細血管作用，通過抗原-抗體結(jié)合及膠體金顯色反應(yīng)來檢測目標(biāo)物質(zhì)。該方法具有操作便捷、成本低廉、結(jié)果判斷簡單、適合于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。本研究對一種石房蛤毒素膠體金快速檢測試紙卡進行了實際應(yīng)用測試，旨在為提高貝毒檢測效率、赤潮期間貝類質(zhì)量安全風(fēng)險防控能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試牡蠣、縊蟶、花蛤等貝類樣品采集于福建沿海地區(qū)，儲存于-20℃低溫冰箱待測。石房蛤毒素(STX)標(biāo)準(zhǔn)品購自臺灣藻研有限公司(Taiwan Algal Science Inc)，1 mg/瓶。石房蛤毒素膠體金快速檢測試紙卡由福建省水產(chǎn)研究所研制，配有提取緩沖液濃縮片劑、50 mL離心管和一次性塑料滴管。

1.2 儀器與設(shè)備

均質(zhì)器；電子天平(精度0.1 g)；小型電磁爐；計時器。

1.3 樣品處理與制備

將貝類樣品的外殼用清水徹底洗凈，切斷閉殼肌，開殼，用蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙等雜質(zhì)，小心取出貝肉，切勿割破貝體，不得以加熱或藥物方式開殼。收集約200 g去殼貝肉瀝水5 min(應(yīng)避免貝肉堆積)，撿出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)備用。

1.4 膠體金快速檢測方法

1.4.1 檢測步驟

取緩沖液片劑5片，用純水配制成500 mL的溶液(可用礦泉水瓶配制)。稱取5 g均質(zhì)后的貝類樣品于50 mL離心管中，加入20 mL上述溶液，稍加振蕩后沸水浴提取10 min，冷卻至室溫，待檢。如未立即檢測，可將提取液冷藏保存，長期保存應(yīng)于-20℃冷凍提取液。使用前應(yīng)將待檢提取液恢復(fù)至室溫。

從原包裝鋁箔袋中取出膠體金快檢試紙卡和一次性滴管，置于水平清潔的桌面上。用一次性滴管吸取待檢樣本，垂直滴加4滴于加樣孔中，加樣后開始計時，3～5 min內(nèi)讀取結(jié)果。如滴加4滴樣本后，判讀窗口仍無紅色層析峰出現(xiàn)，補加1滴樣本，并重新開始計時。肉眼觀察樣品檢測結(jié)果。

1.4.2 結(jié)果判定

石房蛤毒素膠體金快檢試紙卡結(jié)果判定示意圖如圖2所示。

陽性：僅質(zhì)控區(qū)(C)有一條粉紅色帶出現(xiàn)，檢測區(qū)(T)無色帶出現(xiàn)。表明樣品中石房蛤毒素含量大于檢測限。判讀時間若超過10 min，陽性樣品的T區(qū)可能會出現(xiàn)非常淺的色帶，也判定為陽性。

陰性：質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)都有明顯的粉紅色帶出現(xiàn)。表明樣品中不含有石房蛤毒素或含量小于檢測限。

無效：質(zhì)控區(qū)(C)沒有色帶出現(xiàn)。表明操作過程不正確或試紙卡已失效，應(yīng)更換試紙卡重新測定。

注： C.質(zhì)控區(qū)；T.檢測區(qū)。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

按照GB 5009.213—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 貝類中麻痹性貝類毒素的測定》中的LC-MS/MS法進行樣品提取和凈化。

液相色譜條件：色譜柱為Atlantis Hilic Silica色譜柱，50.0 mm×2.1 mm，粒徑3.0 μm；流動相：A為0.1%HCOOH，B為CH3CN，梯度洗脫條件見表1；流速：0.30 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：2.0 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測，優(yōu)化參數(shù)見表2。

使用基質(zhì)加標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將基質(zhì)匹配的不同濃度工作液分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液中石房蛤毒素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量測定。該方法的定量限為100.0 μg/kg。

表1 流動相梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions of mobile phase

表2 多反應(yīng)監(jiān)測優(yōu)化參數(shù)Tab.2 Optimization parameters of multi-reaction monitoring

1.6 試紙卡應(yīng)用測試

1.6.1 添標(biāo)樣品的制備

1 mg/mL石房蛤毒素儲備液：取石房蛤毒素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，加入1 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖液溶解，于4 ℃保存。

10 μg/mL石房蛤毒素工作液：取1 mg/mL石房蛤毒素儲備液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用去離子水定容至刻度，臨用前配制。

250 μg/kg添標(biāo)樣品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液125 μL加入5 g陰性貝類樣品中混勻。

500 μg/kg添標(biāo)樣品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液250 μL加入5 g陰性貝類樣品中混勻。

1 000 μg/kg添標(biāo)樣品：取10 μg/mL石房蛤毒素工作液500 μL加入5 g陰性貝類樣品中混勻。

1.6.2 檢測限測定

取經(jīng)LC-MS/MS法確證為陰性的牡蠣、縊蟶和花蛤樣品，分別制備石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0、250、500和1 000 μg/kg的樣品各10個，按照1.4膠體金快速檢測方法進行檢測和判定。

1.6.3 假陽性率和假陰性率測定

取經(jīng)LC-MS/MS法確證為陰性的牡蠣、縊蟶和花蛤樣品，分別制備10個石房蛤毒素添標(biāo)濃度小于或等于250 μg/kg的貝類樣品(其中6個添標(biāo)濃度為0 μg/kg，4個添標(biāo)濃度為250 μg/kg)和10個石房蛤毒素添標(biāo)濃度大于或等于500 μg/kg的貝類樣品(其中6個添標(biāo)濃度為500 μg/kg，4個添標(biāo)濃度為1 000 μg/kg)，按照1.4膠體金快速檢測方法進行檢測和判定。同時分別以石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0和500 μg/kg的貝類樣品作為試紙卡陰性和陽性對照，計算假陽性率和假陰性率。

1.6.4 實際樣品檢測

取牡蠣、貽貝、縊蟶、花蛤等貝類樣品30個，同時按1.4膠體金快速檢測方法和LC-MS/MS法進行檢測，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙卡的檢測限

用試紙卡分別檢測石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0、250、500和1 000 μg/kg的牡蠣樣品，結(jié)果見圖3。石房蛤毒素添標(biāo)濃度為0和250 μg/kg的樣品，C線和T線均可見，結(jié)果均為陰性；石房蛤毒素添標(biāo)濃度為500和1 000 μg/kg的樣品，C線均可見，T線均無顯色，結(jié)果均為陽性。因此可確定該膠體金快速檢測試紙卡對貝類樣品中石房蛤毒素的檢測限為500 μg/kg。

對于牡蠣、縊蟶、花蛤等3種貝類樣品，當(dāng)石房蛤毒素含量低于250 μg/kg時陽性檢出率為0%；當(dāng)石房蛤毒素含量高于500 μg/kg時陽性檢出率為100%，試紙卡對添加不同濃度石房蛤毒素的樣品的檢測結(jié)果均一致，說明該試紙卡在貝類產(chǎn)品中具有普遍適用性。

2.2 假陽性率和假陰性率

用試紙卡對石房蛤毒素添標(biāo)濃度小于或等于250 μg/kg的貝類樣品進行檢測，10個牡蠣、10個縊蟶和10個花蛤樣品的檢測結(jié)果均為陰性，故試紙卡的假陽性率為0%。

用試紙卡對石房蛤毒素添標(biāo)濃度大于或等于500 μg/kg的貝類樣品進行檢測，10個牡蠣、10個縊蟶和10個花蛤樣品的檢測結(jié)果均為陽性，故試紙卡的假陰性率為0%。

2.3 實際應(yīng)用結(jié)果分析

分別用試紙卡和LC-MS/MS法檢測30個貝類實際樣品中的石房蛤毒素，其中牡蠣10個、貽貝12個、縊蟶4個、花蛤4個，結(jié)果見表3。用LC-MS/MS法檢測時，各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99，具有良好的線性關(guān)系。

檢測結(jié)果顯示，30個貝類樣品經(jīng)LC-MS/MS法檢測，有13個未檢出石房蛤毒素，17個檢出石房蛤毒素，其中10個樣品中石房蛤毒素含量小于500 μg/kg，7個樣品中石房蛤毒素含量大于500 μg/kg。30個貝類樣品經(jīng)試紙卡檢測，23個樣品檢測結(jié)果為陰性，均為石房蛤毒素含量小于500 μg/kg的樣品；7個樣品檢測結(jié)果為陽性，均為石房蛤毒素含量大于500 μg/kg的樣品，表明兩種檢測方法結(jié)果一致。

實際樣品檢測結(jié)果表明，石房蛤毒素膠體金快速檢測試紙卡能檢測出石房蛤毒素大于500 μg/kg的貝類樣品，且快速簡便、穩(wěn)定可靠，適用于貝類樣品中石房蛤毒素的現(xiàn)場快檢，可以應(yīng)用于日常石房蛤毒素檢測篩查工作。

表3 試紙卡與LC-MS/MS法檢測貝類樣品結(jié)果比較Tab.3 Comparison of the results of test strip and LC-MS/MS method in the detection of shellfish samples

3 討論

近年來，我國環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，正常生態(tài)平衡遭到破壞，沿海海域頻繁發(fā)生赤潮，給漁業(yè)生產(chǎn)和百姓健康造成了嚴(yán)重影響，麻痹性貝毒在我國沿海蔓延的潛在危險不容忽視。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因誤食受麻痹性貝毒污染的貝類產(chǎn)品而引發(fā)的中毒事件高達2 000余起，死亡率達15%。我國是貝類養(yǎng)殖大國，牡蠣、貽貝、扇貝、蛤、蟶等養(yǎng)殖貝類產(chǎn)品是我國水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯的重要品種。歐盟和美國是世界上主要的貝類消費地區(qū)，也是我國貝類產(chǎn)品的主要出口國，他們都非常重視貝類安全衛(wèi)生的源頭管理，強調(diào)貝類養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)測與監(jiān)控。為推動貝類養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，保障赤潮期間貝類質(zhì)量安全，促進貝類產(chǎn)品出口貿(mào)易，建立有效的貝毒快速檢測方法，對養(yǎng)殖貝類進行風(fēng)險監(jiān)控是十分必要的。

當(dāng)前麻痹性貝毒的檢測方法可分為生物測定分析法、儀器分析法、免疫測定法和細胞毒性測定法等四類。小白鼠生物測定法是美國分析化學(xué)家協(xié)會(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)認證的檢測PSP的標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)方法，同時也是國際海產(chǎn)品貿(mào)易中的官方方法，目前包括我國在內(nèi)，世界上約有81%的國家使用該方法檢測PSP[14-15]。雖然小白鼠生物測定法在概括樣品毒性方面非常有效，但小鼠間的個體差異會導(dǎo)致檢測結(jié)果準(zhǔn)確性不足，且實驗耗材和前期準(zhǔn)備工作量都較大。高效液相色譜法(HPLC)是較早被應(yīng)用的儀器分析方法之一，與生物測定法相比，其更加準(zhǔn)確高效，專一性強、靈敏度高[16]；但檢測耗時較長，需要配備昂貴的儀器，且對操作人員的技術(shù)要求高，在基層應(yīng)用推廣中難以普及。酶聯(lián)免疫技術(shù)使用了抗原-抗體結(jié)合的原理，靈敏度高，檢測時間相對短，適合快速檢測篩查樣品；但制備多克隆抗體時需大量純化標(biāo)準(zhǔn)品，檢測成本較高[17]。細胞毒性試驗是利用藜蘆堿激活神經(jīng)細胞的Na+通道，使Na+內(nèi)流，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)外離子失調(diào)，引起神經(jīng)細胞死亡，而PSP是Na+通道阻滯劑，因此可通過對比計算細胞死亡率來測定PSP毒性[18]；但由于檢測周期長，操作繁瑣，需要培養(yǎng)較多細胞，所以該方法尚未在我國建立應(yīng)用。隨著麻痹性貝毒檢測實際應(yīng)用需求的不斷增長，更加高效快捷、簡便可靠、低成本的檢測方法仍是研究的主流趨勢。

膠體金快速檢測技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、操作簡便、容易學(xué)習(xí)的特點，非常適用于基層監(jiān)管部門開展大批量的快速定性篩查檢測，應(yīng)用前景廣闊。為此，本研究對福建省水產(chǎn)研究所研制的石房蛤毒素膠體金快速檢測試紙卡進行了應(yīng)用測試，結(jié)果表明，該試紙卡在貝類產(chǎn)品中具有普遍適用性，對石房蛤毒素的檢測限為500 μg/kg，低于國際限量標(biāo)準(zhǔn)800 μg/kg；檢測方法簡單、快速、準(zhǔn)確，單個樣品檢測耗時約20 min，僅需配備簡單小型儀器即可，對檢測人員操作水平要求不高，能夠滿足現(xiàn)場檢測需要。雖然該試紙卡目前只能進行定性檢測，但可作為有效的輔助檢測手段應(yīng)用于貝類樣品的初篩檢測，能對行政指令性的監(jiān)督抽查工作起到良好的補充作用；同時有助于形成“快檢初篩+實驗室確證”的科學(xué)監(jiān)管模式，彌補多年來赤潮災(zāi)害防范工作中麻痹性貝毒監(jiān)測技術(shù)手段的不足，對加強貝類質(zhì)量安全監(jiān)管、提高海洋漁業(yè)赤潮防災(zāi)減災(zāi)能力、進而保障漁業(yè)經(jīng)濟持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。