高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物研究中的應(yīng)用

吳林寰，陸震鳴，龔勁松，史勁松，許正宏,3

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高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物研究中的應(yīng)用

吳林寰1,2，陸震鳴1，龔勁松1，史勁松1，許正宏1,3

1 江南大學(xué)藥學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122 2 中國科學(xué)院微生物研究所，北京100101 3 國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000

高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展對(duì)食品微生物發(fā)酵過程和機(jī)制研究產(chǎn)生了深刻的影響，主要體現(xiàn)在食品微生物生理功能、代謝能力和進(jìn)化的研究以及食品微生物群落結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制等方面。另外，通過對(duì)食品微生物基因組和元基因組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，也對(duì)食品發(fā)酵過程優(yōu)化、微生物功能改造、食源性微生物疾病預(yù)防和控制等提供了重要的依據(jù)。本文總結(jié)了近年來利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)食品微生物基因組和元基因組進(jìn)行測(cè)序的研究，并探討了測(cè)序技術(shù)的發(fā)展對(duì)食品微生物研究的影響及發(fā)展趨勢(shì)。

高通量測(cè)序技術(shù)，食品微生物，元基因組

1 引言

食品微生物是與食品相關(guān)的微生物總稱，主要包括食品發(fā)酵微生物和工業(yè)生產(chǎn)用食品微生物；從廣義角度看，食源性致病微生物也應(yīng)該屬于這個(gè)范疇。

在工業(yè)生產(chǎn)中使用的食品微生物主要是利用其生理特性生產(chǎn)某些食品組分或者改進(jìn)食品的功能。微生物用于食品發(fā)酵在國內(nèi)外均具有非常悠久的歷史，發(fā)酵食品不僅具有重要的食用價(jià)值，也具有重大的工業(yè)價(jià)值。用于發(fā)酵的食品微生物主要包括絲狀真菌、酵母和細(xì)菌，或者是這些微生物共同作用的結(jié)果。在發(fā)酵過程中，食品微生物的主要作用包括可以通過生成乙醇、有機(jī)酸、細(xì)菌素等代謝物抑制其他微生物的生長從而更好地保存食物；通過抑制病原體或者消除有毒化合物來提高食品的安全性；增加食品的營養(yǎng)或者風(fēng)味[1]。例如，酵母菌可以在發(fā)酵過程中將面粉中的糖類物質(zhì)分解產(chǎn)生CO2、醇、醛和有機(jī)酸等物質(zhì)，因此在釀酒的過程中發(fā)揮了重要的作用。乳酸菌是最重要的食品微生物之一，參與了醬油、泡菜等食品發(fā)酵過程，其代謝產(chǎn)生的乳酸能有效防止食物腐爛。醋酸菌則廣泛地運(yùn)用在食醋，可可飲料和白酒的釀造中[2]。近年來，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)食品添加劑迅速發(fā)展，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)醛類、酮類、內(nèi)酯、萜類化合物等風(fēng)味物質(zhì)是食品中風(fēng)味物質(zhì)的重要來源[3]。

另一方面，微生物會(huì)造成食品的腐爛，給人類的健康帶來危害。食源性致病菌是指在食品的加工和流通過程中引入的病原菌，由于其在食品中存活、生長代謝并引起食物的變質(zhì)和破壞，是引發(fā)食品安全事故的主要因素，其中沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌和肉毒梭狀芽孢桿菌等都是重要的食源性致病菌[4]。

早期的食品微生物研究主要依賴于傳統(tǒng)的微生物技術(shù)，如純培養(yǎng)技術(shù)、菌種改造技術(shù)、發(fā)酵條件優(yōu)化技術(shù)等。人們對(duì)食品微生物的研究，產(chǎn)生了大量關(guān)于微生物的生理生化性狀、功能特性、食品發(fā)酵過程參數(shù)等信息。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量的食品微生物基因組和元基因組數(shù)據(jù)，對(duì)食品微生物的研究方法和研究內(nèi)容產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。微生物全基因組是指微生物的完整的基因組核苷酸序列信息，利用該信息能夠分析基因組結(jié)構(gòu)，認(rèn)識(shí)其生物學(xué)功能，對(duì)具有重要應(yīng)用價(jià)值的微生物進(jìn)行深入的研究。由于大量環(huán)境中的微生物難以分離培養(yǎng)，并利用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行全基因組測(cè)序，Handelsman提出了元基因組的概念。元基因組 (Metagenome)，也稱微生物環(huán)境基因組或群落基因組，是指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和未可培養(yǎng)的微生物的基因[5]。元基因組數(shù)據(jù)使得人們能夠系統(tǒng)地分析微生物的代謝、微生物群落的相互作用及其對(duì)環(huán)境的反應(yīng)機(jī)制。

2 高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

1953年，James Watson和Francis Crick共同提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著生命科學(xué)的發(fā)展進(jìn)入了分子生物學(xué)階段，并由此引發(fā)了一場生命科學(xué)和生物技術(shù)革命。隨后，DNA測(cè)序技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生，隨著以Sanger測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的第一代測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，人類基因組計(jì)劃于1990年正式啟動(dòng)，截止到2004年人類基因組計(jì)劃的測(cè)序工作基本完成[6]，正式進(jìn)入了后基因組時(shí)代。傳統(tǒng)的測(cè)序方法已不能滿足測(cè)序深度和測(cè)序效率等大規(guī)模測(cè)序的需求，促使了以羅氏公司的454、Illumina公司的HiSeq以及l(fā)ife technology公司的SOLiD、Ion Torrent為代表的新一代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing，NGS)的誕生[7]，其顯著特點(diǎn)是高通量，測(cè)序準(zhǔn)確率明顯優(yōu)于以Sanger測(cè)序?yàn)榇淼牡谝淮鷾y(cè)序技術(shù)，價(jià)格也大幅降低。454 life sciences 是2004年左右推出的第一批基于焦磷酸測(cè)序法的商用超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)，有速度快、讀長較長、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢(shì)，但由于其通量低、成本高等缺點(diǎn)，目前已逐步退出市場。隨著對(duì)測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)，Illumina、life technology等公司生產(chǎn)的新一代高通量測(cè)序平臺(tái)開始占據(jù)主流地位。Illumina公司的Solexa和Hiseq是目前占據(jù)主要市場的第二代測(cè)序儀，采用的是邊合成邊測(cè)序的方法，具有通量高、耗時(shí)短、成本低等特點(diǎn)。life technology推出的Ion Torrent的核心技術(shù)是通過半導(dǎo)體技術(shù)在化學(xué)和數(shù)字信息之間建立聯(lián)系，解讀堿基信號(hào)，具有準(zhǔn)確性高、速度快、成本低的優(yōu)勢(shì)[8]。

3 利用高通量測(cè)序技術(shù)開展食品微生物研究的發(fā)展迅猛

由于測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，使得進(jìn)行全基因組測(cè)序無論是時(shí)間還是費(fèi)用都大幅降低，因此近年來對(duì)食品微生物基因組和元基因組的研究也呈現(xiàn)出迅猛增長的態(tài)勢(shì)。基因組分析能夠系統(tǒng)研究單個(gè)微生物的代謝過程以及對(duì)環(huán)境的響應(yīng)。中國學(xué)者對(duì)分離自馬奶酒中的專利菌干酪乳桿菌BD-II[9]和酸奶發(fā)酵菌株保加利亞乳桿菌subsp. bulgaricus strain ND02[10]，韓國學(xué)者對(duì)泡菜發(fā)酵的香腸乳桿菌[11]、棒狀乳桿菌subsp. coryniformis[12]和高麗魏斯氏菌[13]，德國學(xué)者對(duì)分離自奶酪表面的變異棒狀桿菌[14]和棒狀桿菌[15]都相繼進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并且進(jìn)行了相關(guān)的比較基因組、代謝能力的分析。

由于測(cè)序效率以及測(cè)序質(zhì)量的提高，越來越多的物種被進(jìn)行全基因組重測(cè)序(Resequencing)。全基因組重測(cè)序是對(duì)已知參考基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體間的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析，剖析物種遺傳和進(jìn)化的過程，獲得新的功能基因。2014年，日本學(xué)者Kamada等同時(shí)利用第三代測(cè)序儀PacBio RS sequencer和第二代測(cè)序儀Illumina MiSeq對(duì)納豆枯草芽孢桿菌BEST195進(jìn)行了重測(cè)序，得到了一個(gè)更為完整和高質(zhì)量的全基因組序列，填補(bǔ)了之前對(duì)該菌株測(cè)序的空白部分，并發(fā)現(xiàn)了330個(gè)新的蛋白質(zhì)編碼序列[16]。

由于測(cè)序成本的大幅降低，對(duì)不同的亞種和菌株進(jìn)行測(cè)序，利用比較基因組的方法，構(gòu)建某個(gè)物種的泛基因組 (Pan-Genome) 也成為可能。2005年，Tettelin等提出了微生物泛基因組概念，包括核心基因組 (Core genome) 和非必需基因組 (Dispensable genome)。其中，核心基因組指的是在所有菌株中都存在的基因；非必需基因組指的是僅在部分菌株中存在的基因，由于非必需基因的數(shù)量巨大，泛基因組比單個(gè)基因組的要大幾個(gè)數(shù)量級(jí)[17]。泛基因組對(duì)于研究微生物在不同環(huán)境的適應(yīng)性具有重要的價(jià)值。2013年，Tamara等對(duì)34株不同的副干酪乳桿菌菌株進(jìn)行了測(cè)序和比較基因組分析，包括其核心基因組和非必需基因組。每個(gè)基因組大概包含2 800–3 100蛋白質(zhì)編碼基因，其泛基因組大概包括4200個(gè)直系同源，其中1800個(gè)為必需基因。必需基因包括與宿主相互作用相關(guān)的基因和一些形成支鏈脂肪酸的基因，可變基因包括一些假設(shè)蛋白、糖代謝或者細(xì)胞表面相關(guān)的蛋白，EPS合成蛋白等，說明了對(duì)不同生態(tài)的適應(yīng)性[18]。

食品微生物發(fā)酵通常是一個(gè)復(fù)雜的過程，在發(fā)酵微生物群落中存在著大量難以培養(yǎng)的微生物，元基因組測(cè)序分析成為研究微生物群落動(dòng)態(tài)變化及其相互作用的重要手段[19]，在傳統(tǒng)食品如泡菜、白酒，規(guī)?；墓I(yè)發(fā)酵如啤酒、乳制品以及研究食品的腐敗過程中，都已經(jīng)廣泛地使用。中國學(xué)者對(duì)普洱茶發(fā)酵過程的元基因組進(jìn)行了測(cè)序分析，得到了微生物的群落結(jié)構(gòu)和代謝功能的基本信息，并對(duì)萜類和酮類化合物等次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑進(jìn)行了詳細(xì)分析[20]。日本學(xué)者Takahashi利用高通量測(cè)序?qū)I(yè)規(guī)模的啤酒和啤酒類飲料的發(fā)酵過程的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的菌群多樣性隨著煮沸、發(fā)酵前期、發(fā)酵后期、過濾等過程，產(chǎn)生了極大的變化[21]。愛爾蘭學(xué)者通過對(duì)奶酪發(fā)酵中一天的不同時(shí)間段的微生物群落進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，由于環(huán)境因素的變化，在奶酪發(fā)酵的整個(gè)過程中，稍晚時(shí)間段的奶酪比稍早時(shí)間段的有著更加豐富的細(xì)菌多樣性[22]。

MG-RAST (http://metagenomics.anl.gov/) 是由美國阿貢國家實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的對(duì)元基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行儲(chǔ)存和分析的一個(gè)重要平臺(tái)，目前已經(jīng)注釋了超過20萬個(gè)元基因組，并開放了3萬多個(gè)元基因組的原始信息。其中，與食品微生物相關(guān)的元基因組項(xiàng)目見表1。由表中可見，進(jìn)行食品微生物元基因組分析的樣本主要來自于牛奶、奶酪等乳制品以及泡菜等發(fā)酵食品。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的種類既包括利用16S rRNA分析元基因組的多樣性，又包括對(duì)整個(gè)元基因組進(jìn)行測(cè)序，分析其群落功能和代謝能力。

表1 重要的元基因組測(cè)序項(xiàng)目及數(shù)據(jù)

Data source：http://metagenomics.anl.gov/

4 高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物研究中的主要應(yīng)用

4.1 全基因組測(cè)序在改善食品微生物功能研究中的應(yīng)用

通過對(duì)食品中的微生物進(jìn)行全基因組測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，能夠幫助預(yù)測(cè)對(duì)發(fā)酵過程或者產(chǎn)品的性能產(chǎn)生重要作用的基因，提供關(guān)于菌種的代謝途徑及其與環(huán)境之間相互作用的信息，從而對(duì)菌種進(jìn)行篩選和優(yōu)化提供重要的指導(dǎo)，提高菌種性能。隨著乳制品行業(yè)的發(fā)展，以及人們對(duì)健康的關(guān)注，越來越多的益生菌被測(cè)序。2012年，印度學(xué)者Prajapati等相繼對(duì)瑞士乳桿菌[23]、鼠李糖乳桿菌[24]和嗜熱鏈球菌[25]進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)MTCC 5461和CNRZ 1066進(jìn)行了比較基因組分析。通過分析，表明與益生特性相關(guān)的基因如耐酸(谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、β-半乳糖苷酶、產(chǎn)細(xì)菌素等在這兩個(gè)基因組中都相對(duì)保守，MTCC 5461的基因組中，還含有一些DNA調(diào)控和合成的特有基因。但是，在其他致病性的鏈球菌屬，如釀膿鏈球菌和肺炎鏈球菌中，普遍存在的編碼解旋酶RecQ的基因，在MTCC 5461和CNRZ 1066等益生菌中則不存在，RecQ是負(fù)責(zé)維持基因組穩(wěn)定性的重要酶。

全基因組測(cè)序是研究微生物多樣性的一個(gè)重要手段，隨著測(cè)序數(shù)據(jù)的不斷豐富，通過對(duì)同屬或同種內(nèi)的菌種基因組序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)存在著相當(dāng)大的基因和功能的多樣性?？梢园l(fā)現(xiàn)，由于不同的環(huán)境原因，對(duì)同屬內(nèi)菌種或同種內(nèi)菌株在基因的構(gòu)成或表達(dá)水平上，也有著顯著的差異，對(duì)于食品微生物的研究也有著重要的意義。對(duì)食品來源的微生物和非食品中的微生物進(jìn)行比較分析研究，能夠發(fā)現(xiàn)很多對(duì)于食品的功能特性有重要價(jià)值的基因。荷蘭學(xué)者Bachmann等對(duì)分離乳制品和非乳制品來源的84株乳酸鏈球菌中涉及氮代謝和脂肪酸代謝的5種關(guān)鍵酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在基因的表達(dá)和調(diào)控方面存在顯著的差異，也說明基因調(diào)控的變化是菌種進(jìn)化的重要?jiǎng)?力[26]。腸球菌是一種能造成菌血癥、心內(nèi)膜炎等感染的重要的致病菌，然而，近年的研究發(fā)現(xiàn)，的某些菌株不僅沒有致病性，反而是作為一種益生菌在使用。例如屎腸球菌T-110 能夠緩解腹瀉并且促進(jìn)康復(fù)，已經(jīng)作為一種益生產(chǎn)品在廣泛使用。2015年，印度學(xué)者對(duì)T-110進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并且與致病性和非致病性的進(jìn)行了比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)T-110有348個(gè)特有的開放閱讀框架，編碼ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)酶，細(xì)菌素以及細(xì)菌素相關(guān)的膜整合蛋白，這些蛋白大部分都具有已知的抗菌活性。而與VFDB數(shù)據(jù)庫中的40個(gè)毒性基因進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)包括屎腸球菌表面蛋白 (esp) 在內(nèi)的32個(gè)毒性基因是不存在的，這也說明即使是同一屬內(nèi)的菌株，由于環(huán)境的差異也會(huì)導(dǎo)致進(jìn)化差異[27]。

水平基因轉(zhuǎn)移 (Horizontal gene transfer, HGT) 指在差異生物個(gè)體之間，或單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器之間所進(jìn)行的遺傳物質(zhì)的交流。進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的個(gè)體可以是遠(yuǎn)緣的，甚至沒有親緣關(guān)系的生物個(gè)體。發(fā)生在食品微生物之間的水平基因轉(zhuǎn)移會(huì)使微生物產(chǎn)生新的代謝特征，例如對(duì)底物的利用、細(xì)菌素、表多糖、生物胺的產(chǎn)量，抗生素抗性等。如果通過基因轉(zhuǎn)移獲得的有利的基因，能夠促使性狀得到改變或者發(fā)酵過程的指標(biāo)得到提升，相反，如果獲得的是有害的基因，則會(huì)有可能產(chǎn)生食品安全等問題[28]。通過比較基因組學(xué)的方法，能夠研究食品微生物的水平基因轉(zhuǎn)移。希臘學(xué)者Konstantinos等對(duì)從乳制品中分離的ACA-DC 198進(jìn)行比較基因組研究發(fā)現(xiàn)，其基因組中含有能夠適應(yīng)牛奶環(huán)境的基因，例如乳糖和半乳糖代謝，酪蛋白水解系統(tǒng)，噬菌體抗性能力等基因簇，這些基因簇都展示了與無乳鏈球菌、中鏈球菌、乳酸乳球菌和等菌株之間極高的序列相似性，顯示這些菌株可能是水平基因轉(zhuǎn)移的供體[29]。

利用性能更加優(yōu)異的出發(fā)菌株，或者優(yōu)化發(fā)酵的過程，是提高食品發(fā)酵產(chǎn)物的口味、功能物質(zhì)、營養(yǎng)成分、產(chǎn)量的重要手段。利用全基因組數(shù)據(jù)，進(jìn)行全基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，利用計(jì)算的方法，對(duì)代謝能力進(jìn)行預(yù)測(cè)和模擬，實(shí)現(xiàn)菌株的改造或者發(fā)酵過程的優(yōu)化。目前，對(duì)釀酒酵母的研究日益增加，產(chǎn)生了大量的基因組數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將二者結(jié)合，對(duì)釀酒酵母進(jìn)行全基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，利用這個(gè)模型就能夠?qū)Πl(fā)酵過程中的代謝物的產(chǎn)生和消耗進(jìn)行研究，模擬在不同條件下代謝反應(yīng)的過程，從而對(duì)基因的功能進(jìn)行更加準(zhǔn)確的研究[30]?；蚪M規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)可以用來研究基因型和表型之間的關(guān)系，比較不同物種之間的差異，也能夠提供一個(gè)整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組數(shù)據(jù)的框架。在乳酸菌研究方面，目前已經(jīng)有4個(gè)物種建立了代謝模型。MG1363 的代謝模型用來研究奶酪發(fā)酵中的碳代謝和氮代謝形成風(fēng)味物質(zhì)的過程[31]。胚芽乳桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)用來評(píng)估菌種的營養(yǎng)需求[32]。羅伊氏乳桿菌JCM1112 的代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)用來研究菌株的益生特性[33]。ATCC 334和12A的代謝網(wǎng)絡(luò)模型用來分析基因型和菌種的生理功能之間的關(guān)系，從而為菌種的工業(yè)改造提供依據(jù)[34]。

4.2 高通量測(cè)序技術(shù)在食品安全研究中的應(yīng)用

食品安全是食品工業(yè)中的一個(gè)重要研究領(lǐng)域，其中，由于微生物腐敗導(dǎo)致的食品安全問題是研究重點(diǎn)。利用全基因組測(cè)序，對(duì)食品中的有害微生物進(jìn)行全基因組測(cè)序，從而進(jìn)行包括毒力因子的鑒定，生存機(jī)制的研究等。魚乳球菌是導(dǎo)致食品腐敗的嗜冷乳酸菌，主要在冷藏的包裝肉類食品中分離得到。芬蘭學(xué)者M(jìn)argarita等對(duì)MKFS47進(jìn)行全基因組測(cè)序并將其與的其他29個(gè)基因組進(jìn)行了比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)在生成腐爛物質(zhì)的過程中，丙酮酸代謝途徑上存在差異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)變成了異型發(fā)酵，同時(shí)，MKFS47所特有的基因，使其能夠產(chǎn)生對(duì)肉類物質(zhì)有害的化合物[35]。環(huán)境和過程的參數(shù)的不同，可能對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化產(chǎn)生影響，從而影響導(dǎo)致食品腐爛變質(zhì)的微生物的生長差異，引起食品安全問題。利用快速的16S rRNA測(cè)序的方法，對(duì)環(huán)境和過程的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有助于了解微生物的生存機(jī)制，并做出有效地控制。通過對(duì)存儲(chǔ)在真空、空氣和氣調(diào)保鮮包裝等不同環(huán)境中牛排中的微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝物的變化進(jìn)行監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)牛肉的存儲(chǔ)時(shí)間隨著微生物的群落結(jié)構(gòu)以及代謝物的產(chǎn)生有著巨大的差異，從而能對(duì)牛肉的保鮮條件進(jìn)行指導(dǎo)[36]。

高通量測(cè)序在分析微生物所引起的食品安全事件中也發(fā)揮著重要的作用。與傳統(tǒng)方法相比，高通量測(cè)序能快速、準(zhǔn)確地提供毒株的基因組特征信息，從而對(duì)引起疾病的微生物菌株進(jìn)行溯源研究。沙門氏菌是1種常見的食源性致病菌，在各類細(xì)菌性食物中毒中占有極高的比例。全基因組測(cè)序的方法目前已經(jīng)廣泛地運(yùn)用到了沙門氏菌引起的食物中毒的溯源和追蹤研究中。英國科學(xué)家通過全基因組測(cè)序分析了2013年暴發(fā)的沙門氏菌感染，證實(shí)了分離自蛋黃醬的鼠傷寒沙門氏桿菌DT 8導(dǎo)致人類感染[37]。為了實(shí)現(xiàn)快速鑒定的目的，Georgia大學(xué)的科學(xué)家建立了SeqSero數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)Σ煌逍偷脑紲y(cè)序數(shù)據(jù)或者全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。

2012年3月，由美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA)，加州大學(xué)戴維斯分校，安捷倫公司，美國疾病預(yù)防和控制中心等機(jī)構(gòu)共同合作，提出100 K食源性病原微生物基因組測(cè)序計(jì)劃。該計(jì)劃的目的是利用高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行10萬株食源性病原菌基因組測(cè)序，從而建立最大的公共數(shù)據(jù)庫，研究致病菌的致病性、藥物反應(yīng)等生物特性，以幫助鑒定食源性病原菌并進(jìn)行溯源，從而在食源性危機(jī)爆發(fā)時(shí)，在最短的時(shí)間能夠進(jìn)行反應(yīng)和處理。該項(xiàng)目測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)將全部通過NCBI進(jìn)行公開，對(duì)食品安全研究提供最重要的參考數(shù)據(jù)源(http://100kgenome.vetmed.ucdavis.edu/index.cfm)。

4.3 利用高通量測(cè)序進(jìn)行食品微生物元基因組研究

食品微生物發(fā)酵作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵過程，通常是混合發(fā)酵，其微生物的菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，且具有難以分離或培養(yǎng)的成分，因此，通常對(duì)于發(fā)酵過程及菌群間的相互作用知之甚少，而元基因組的方法不需要對(duì)菌株進(jìn)行分離而直接測(cè)序，對(duì)于食品微生物的群落研究非常有效。

在對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化的研究中，通過16S rRNA測(cè)序，能夠快速和高效地監(jiān)控發(fā)酵過程中的參數(shù)變化，如原材料的量，菌種條件，群落結(jié)構(gòu)等動(dòng)態(tài)變化，將微生物的群落結(jié)構(gòu)和過程參數(shù)進(jìn)行結(jié)合分析。例如，為了研究汾酒的微生物發(fā)酵群落結(jié)構(gòu)和發(fā)酵過程的微生物的組成，對(duì)細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS序列克隆文庫和焦磷酸測(cè)序分別進(jìn)行了測(cè)序。結(jié)果顯示，相較真菌，細(xì)菌有著更加豐富的多樣性，在窖泥的表面，主要是乳桿菌科Lactobacillaceae，而在空氣和水分相對(duì)稀少的窖泥內(nèi)部，則主要是以芽孢桿菌科Bacillacae為主。真菌的含量在汾酒發(fā)酵過程中保持相對(duì)穩(wěn)定[38]。

然而，由于16S rRNA序列的高度保守性，對(duì)于相似性較高的種或菌株則難以用來進(jìn)行分析。此時(shí)，通過對(duì)整個(gè)群落的基因進(jìn)行直接測(cè)序則能夠?qū)ξ⑸锶郝溥M(jìn)行更加系統(tǒng)的研究，也更加全面地了解食品發(fā)酵過程中微生物群落的復(fù)雜性。美國哈佛大學(xué)學(xué)者Wolfe對(duì)24種不同的奶酪表皮群落進(jìn)行了元基因組直接測(cè)序，揭示了其中24種主要的細(xì)菌和真菌，并將其作為一種模式生態(tài)系統(tǒng)，用來研究微生物之間的相互作用和變化機(jī)制[39]。

微生物元基因組的研究及數(shù)據(jù)的分析很大程度上依賴于參考菌株數(shù)據(jù)庫的豐富度。例如，傳統(tǒng)奶酪的發(fā)酵是一個(gè)典型的微生物群落作用的結(jié)果，然而，目前對(duì)奶酪發(fā)酵的群落結(jié)構(gòu)、安全性、不同微生物作用等特征的研究還不夠成熟，一個(gè)重要的原因就是參考菌株數(shù)據(jù)庫的缺乏。Almeida等利用低成本測(cè)序方法建立了一個(gè)奶酪菌群的參考菌群數(shù)據(jù)庫，挑選了分離自乳制品的67個(gè)屬137個(gè)物種的142株細(xì)菌的基因組進(jìn)行了測(cè)序，并且重構(gòu)了117個(gè)基因組。其中克呂沃爾菌屬、黃球菌屬和海生乳桿菌屬等微生物的信息目前在公共數(shù)據(jù)庫中還未出現(xiàn)，對(duì)乳制品微生物群落研究起到了重要的作用[40]。

對(duì)微生物群落不同角色的功能研究就更加困難，利用元基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建元代謝途徑 (meta-pathway)，能夠?yàn)槲⑸锶郝涞拇x特征提供更加詳細(xì)的解析。例如，利用元基因組測(cè)序的方法，對(duì)巴西可可豆菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酵母、乳酸菌和醋酸菌是發(fā)酵菌群的主要微生物，其中，酵母主要在發(fā)酵的初始階段用于可可漿的脫水作用，碳水化合物的分解并產(chǎn)生乙醇。在發(fā)酵過程中，乳酸菌的作用能消耗葡萄糖、果糖和檸檬酸，從而產(chǎn)生乳酸、醋酸和甘露醇。隨著環(huán)境的變化，醋酸菌逐漸發(fā)揮了主要作用，將乙醇和乳酸氧化成醋酸再進(jìn)一步將醋酸氧化生成二氧化碳和水[41]。但是，在這個(gè)過程中具體的代謝途徑、某條特定的代謝途徑對(duì)于化合物生成的作用、各個(gè)物種之間的相互作用及其機(jī)制都是不清楚的。因此，Illeghems等進(jìn)一步地基于元基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了元代謝途徑，詳細(xì)解析了可可豆發(fā)酵過程中不同微生物在各代謝物產(chǎn)生中的作用[42]。

5 展望

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因組與元基因組技術(shù)成為食品微生物研究最重要的推動(dòng)力之一。2008年P(guān)acBio公司開發(fā)了第三代單分子測(cè)序技術(shù)，以其更快速、更準(zhǔn)確和更廉價(jià)等特點(diǎn)為未來測(cè)序市場帶來顛覆性的影響。未來，高通量測(cè)序技術(shù)將進(jìn)一步在以下方面為食品微生物研究提供重要的支持：1) 利用基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)與模擬，能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)行系統(tǒng)水平的研究，并為微生物的調(diào)控提供重要線索；2) 利用基因組技術(shù)、元基因組技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組、代謝組等其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，能夠更加全面地研究食品微生物群落的代謝物、代謝能力、生態(tài)組成和動(dòng)態(tài)變化等信息；3) 利用生物信息學(xué)工具和大數(shù)據(jù)的方法，建立預(yù)測(cè)模型，對(duì)食品微生物及其群落的特征及其變化進(jìn)行研究，也將成為一個(gè)重要的方向。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Application of next generation sequencing in studying food microorganisms–a review

Linhuan Wu1,2, Zhenming Lu1, Jinsong Gong1, Jinsong Shi1, and Zhenghong Xu1,3

1,,,214122,,2,,100101,3,646000,,

Next generation sequencing technology has revolutionized studies in fermentation process, in particular, to explore the mechanism by which food microorganisms, including physiology, metabolic pathways, diversity and dynamic changes of microbial community. In addition, phylogenetic characteristics of different species or strains of the food microorganisms are disclosed. All these aspects will help explain how the microbes are interacting and responding to environmental factors. Bioinformatics analysis of genome and metagenome sequence data of food microorganisms could provide essential clues to improve fermentation process and function of microbes as well as control and prevention of foodborne disease outbreak. In this review, we summarized recent genomics and metagenomics studies on food microorganisms. The impact of next generation sequencing for the development and trends of food microorganism researches were discussed in details.

next generation sequencing, food microorganism, metagenomics

December 25, 2015; Accepted: June 12, 2016

Zhenghong Xu. Tel: +86-510-85918206; E-mail: zhenghxu@jiangnan.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31271922), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2012AA021301, 2014AA021501, 2013AA102106).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31271922)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (Nos. 2012AA021301，2014AA021501，2013AA102106)資助。

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