基于納米抗體CDR3區(qū)抗原表位展示制備生存素抗體及其鑒定

王蕾，霍景瑞，張國安，賈力，楊曉暉，張晶晶，劉穎，劉英富，1b

1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 a.病原生物與免疫學(xué)教研室，b.科技實驗中心，河北 滄州 061001；2.滄州市納米抗體技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 滄州

抗體作為抗原可以刺激機體產(chǎn)生針對抗體的抗體，這類具有抗原作用的抗體也稱為抗原化抗體[1]?？贵w作為抗原刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，與其結(jié)構(gòu)的互補決定區(qū)（complementarity determining region，CDR）密切相關(guān)，CDR變化程度高，氨基酸序列多樣，該區(qū)不但是結(jié)合抗原的關(guān)鍵位置，同樣也是抗體具有免疫原性的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)抗體改造后作為抗原進(jìn)行抗體的制備研究，已有相關(guān)的研究報道[2-3]，而傳統(tǒng)抗體由于分子大，制備工藝復(fù)雜，同時作為抗原免疫后非特異性抗體產(chǎn)生種類較多，增加了后續(xù)篩選難度。納米抗體作為一種新型的小分子抗體，可用來展示抗原表位，有望發(fā)揮更大的作用。

納米抗體來源于駱駝重鏈抗體。與傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)不同，駱駝重鏈抗體只含有2條重鏈，不存在輕鏈，重鏈抗體的可變區(qū)是抗原結(jié)合的核心，單獨具有結(jié)合抗原的能力，納米抗體即為駱駝重鏈抗體的可變區(qū)序列，結(jié)構(gòu)上同樣存在互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3，有著很好的抗原結(jié)合能力，在診斷、治療等很多領(lǐng)域得到應(yīng)用[4-6]。有關(guān)納米抗體能否用來展示抗原表位，進(jìn)行抗體制備，少有研究報道。生存素（survivin）是一種腫瘤凋亡抑制蛋白，在惡性腫瘤中的表達(dá)具有高度特異性，與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，該靶點具有很好的診斷、治療價值。本研究選擇生存素部分表位加入CDR3，探討納米抗體抗原表位的展示功能。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：scxk（京）2014-0004］；宮頸癌細(xì)胞株HeLa、Nb-SurvivinE偶聯(lián)凝膠介質(zhì)購自天津泰科迪恩生物科技有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）、pET24a表達(dá)載體為本實驗室保存；生存素由本實驗室表達(dá)純化；展示生存素N端表位（氨基酸序列1～15）的納米抗體（Nb-SurvivinE）基因由北京中美泰和生物科技有限公司合成；內(nèi)切酶、膠回收試劑盒、DNA連接酶、DL2000 DNA marker、蛋白 marker、兔抗小鼠二抗均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；免疫佐劑購自Sigma公司。

1.2 生存素表位選擇與Nb-SurvivinE基因合成

前期實驗室完成駝外周血淋巴細(xì)胞采集、分離，設(shè)計引物擴增并測序得到多個納米抗體序列，隨機選擇其中一個作為表位展示載體。通過基因合成的方式將生存素N端1～15氨基酸插入納米抗體CDR3，合成含生存素N端表位的納米抗體Nb-SurvivinE基因，合成的基因含EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點。

1.3 Nb-survivinE原核表達(dá)載體構(gòu)建、表達(dá)、純化

將合成的Nb-SurvivinE基因、原核表達(dá)載體pET24a分別用內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物分別用膠回收，用連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定陽性的宿主菌進(jìn)一步測序鑒定，測序正確的樣品于37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600nm達(dá)到0.8時，加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，4 h后結(jié)束誘導(dǎo)，收集樣本超聲處理，將超聲后的上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，根據(jù)蛋白的表達(dá)結(jié)果，大量制備Nb-SurvivinE抗原，用His標(biāo)簽金屬螯合親合層析填料純化。

1.4 Nb-SurvivinE免疫及血清效價檢測

用Nb-SurvivinE抗原免疫6～8周雌性BALB/c小鼠，100 μg/只，初次免疫用弗氏完全佐劑蛋白乳化，腹腔注射，初次免疫后第14、21、28、35 d，用弗氏不完全佐劑蛋白乳化，腹腔注射，最后一次免疫1周后，取血檢測效價，效價達(dá)1∶100 000以上，視為免疫成功。

1.5 Nb-survivinE多抗純化及效價檢測

小鼠眼眶取血，離心收集上清并與結(jié)合緩沖液1∶1混合，用0.45 μm濾器過濾，Nb-SurvivinE偶聯(lián)介質(zhì)上樣純化，用結(jié)合緩沖液沖洗柱至檢測器基線，用pH2.7的Glycine-HCl洗脫液洗脫，洗脫樣品用1 mol/L pH9.0的Tris-HCl緩沖液快速中和，SDS-PAGE檢測純化效果，ELISA檢測純化抗體的效價，以未免疫的小鼠多抗作為對照。

1.6 Western印跡檢測Nb-survivinE多抗特異性

檢測樣品包括Nb-SurvivinE、生存素、HeLa細(xì)胞裂解液，以不含生存素表位的納米抗體（Nb-C）做對照。SDS-PAGE結(jié)束后電轉(zhuǎn)PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，以Nb-survivinE偶聯(lián)介質(zhì)純化的抗體作為一抗（1∶10 000），4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，兔抗小鼠二抗1∶10 000稀釋，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入發(fā)光液檢測，未免疫血清為對照。

2 結(jié)果

2.1 Nb-SurvivinE載體構(gòu)建及鑒定

通過基因合成的方式合成Nb-SurvivinE，即將生存素N端序列插入納米抗體的CDR3，酶切連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取4個菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果其中1個未見條帶，3個出現(xiàn)陽性條帶，分子大小與預(yù)測值（396 bp）一致（圖1）。3個陽性克隆中隨機選取1個送檢測序，測序結(jié)果正確。

圖1 Nb-SurvivinE菌液PCR鑒定

2.2 Nb-SurvivinE表達(dá)及純化

Nb-SurvivinE經(jīng)原核表達(dá)IPTG誘導(dǎo)后，SDSPAGE結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量15×103位置有目的條帶表達(dá)，經(jīng)超聲破碎處理，表達(dá)的蛋白主要以包涵體形式存在于超聲沉淀中（圖2A），經(jīng)包涵體洗滌，8 mol/L尿素裂解的蛋白進(jìn)行His標(biāo)簽純化，經(jīng)5、10、20 mmol/L低濃度咪唑去除雜蛋白，100 mmol/L高濃度咪唑洗脫，得到純度大于96%的目的蛋白（圖2B）。

圖2 Nb-SurvivinE表達(dá)（A）與純化（B）的SDS-PAGE

2.3 Nb-survivinE血清效價檢測

純化的Nb-SurvivinE經(jīng)復(fù)性處理后，免疫雌性BALB/c小鼠，免疫5次后，第6周小鼠眼眶取血，采用間接ELISA檢測效價，免疫后的小鼠血清效價均可達(dá)到1∶512 000（圖3）。

圖3 Nb-SurvivinE免疫血清效價檢測

2.4 Nb-SurvivinE免疫血清純化及檢測

用抗原偶聯(lián)介質(zhì)純化免疫后的小鼠血清，得到抗Nb-SurvivinE多抗（pAn-Nb-SurvivinE），SDS-PAGE檢測抗體純化效果，能明顯觀察到重鏈、輕鏈2條帶（圖4A），純化后的抗體經(jīng)梯度稀釋，抗體濃度約為0.02 ng/μL時仍能夠檢測到陽性反應(yīng)（圖4B）。

圖4 Nb-SurvivinE抗體純化（A）及檢測（B）

2.5 Western印跡鑒定Nb-SurvivinE多抗特異性

將Nb-C、Nb-SurvivinE、生存素、HeLa細(xì)胞裂解液依次上樣，分別用純化的pAn-Nb-SurvivinE多抗、Nb-SurvivinE免疫血清及對照血清進(jìn)行檢測。Western印跡結(jié)果顯示pAn-Nb-SurvivinE能夠特異性結(jié)合Nb-SurvivinE、生存素、HeLa細(xì)胞裂解液中的生存素（圖5A），Nb-SurvivinE免疫血清可以檢測到與Nb-C、Nb-SurvivinE、生存素、HeLa細(xì)胞裂解液的陽性反應(yīng)（圖5B），對照血清與上述樣品均未反應(yīng)。

圖5 Western印跡檢測Nb-SurvivinE抗體特異性

3 討論

抗體是生命科學(xué)研究的重要工具，抗原免疫是激發(fā)機體抗體產(chǎn)生的主要方式。由于抗原種類、性質(zhì)的多樣性，也產(chǎn)生了多種抗體制備方法，抗原化抗體是抗原表位展示的一種方法。本研究采用納米抗體展示抗原表位。與傳統(tǒng)抗體比較，納米抗體易于制備，同時，納米抗體CDR3比傳統(tǒng)抗體的相應(yīng)區(qū)域長，彌補了輕鏈缺失造成的抗原結(jié)合力下降，較長的CDR3對抗體的免疫原性有重要貢獻(xiàn)[7]。

本研究選擇生存素作為靶基因。生存素是有絲分裂紡錘體相關(guān)蛋白，參與有絲分裂紡錘體功能與哺乳動物細(xì)胞凋亡的激活，與宮頸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-11]。生存素結(jié)構(gòu)中含有4個α螺旋、3個β折疊，螺旋和折疊不利于表位的展示，因此我們選擇生存素中不含螺旋、折疊結(jié)構(gòu)的N端起始氨基酸序列用來表位展示。通過基因合成方式，將生存素N端15個氨基酸序列插入納米抗體的CDR3并進(jìn)行原核表達(dá)。雖然納米抗體具有很好的可溶性[12]，但本研究表達(dá)的含生存素表位的納米抗體主要以包涵體形式存在，其原因可能與選擇的表達(dá)載體有很大的關(guān)系，研究所選擇的pET24a表達(dá)系統(tǒng)有很強的原核表達(dá)能力，表達(dá)量大、表達(dá)速度快，這可能是影響目的蛋白可溶性的主要原因。為了使生存素抗原表位盡可能以空間結(jié)構(gòu)的形式存在，對包涵體進(jìn)行了復(fù)性處理，并用復(fù)性的Nb-SurvivinE抗原免疫動物，獲得了針對Nb-SurvivinE的多抗。

在對多抗的檢測中，我們選擇Nb-C、Nb-SurvivinE、生存素、HeLa細(xì)胞裂解液進(jìn)行特異性檢測。Western印跡結(jié)果顯示，Nb-SurvivinE偶聯(lián)介質(zhì)純化獲得的多抗僅能檢測到Nb-SurvivinE、生存素、HeLa細(xì)胞裂解液陽性反應(yīng)，而未純化的免疫血清不但能夠檢測到上述3種樣品，還可以檢測出不含生存素表位的Nb-C對照納米抗體，提示納米抗體作為載體進(jìn)行表位展示時，不但產(chǎn)生針對CDR3表位的抗體，還產(chǎn)生了針對納米抗體其他部位的抗體。因此，納米抗體用來進(jìn)行抗原表位展示免疫應(yīng)用時，如希望得到特異性高的抗體，仍須進(jìn)一步進(jìn)行單克隆抗體的篩選研究。。

綜上所述，我們采用納米抗體CDR3展示生存素抗原表位的方法，制備了針對完整生存素的抗體，初步證實了納米抗體作為載體蛋白在抗原表位展示中的作用。納米抗體其他可變區(qū)是否能夠用來進(jìn)行表位展示，多可變區(qū)同時進(jìn)行表位展示是否具有更好的效果，需要更多的實驗研究去證實。