超高效液相色譜-串聯質譜法測定羅非魚血漿和肌肉中的丁香酚殘留

林麗聰

(福建省淡水水產研究所，福州 350002)

丁香酚，分子式為C10H12O2，化學名為2-甲氧-4-丙烯基酚，是一種香料，對魚有強烈的麻醉作用，因其價廉易得，且能夠快速從血液和組織中排出等優(yōu)點[1]，日本、新西蘭和澳大利亞等國將丁香酚列為安全可靠的漁用麻醉劑[2-3]，但其安全性仍存在一定爭議。據歐洲食品安全局(EFSA)報告稱，丁香酚具有肝毒性，可能會造成肝臟損傷[4]；美國國家毒理學計劃(NTP)認為丁香酚屬于可疑致癌物質[5]，因此，美國和加拿大迄今為止未批準丁香酚類化合物為合法的漁用麻醉劑[6-7]。日本雖允許丁香酚作為漁用麻醉劑使用，但規(guī)定其最高殘留限量(MRL)為0.05 mg/kg[8]。中國相關部門至今并沒有批準丁香酚類漁用麻醉劑應用于水產品，但據相關調研表明，鮮活水產品流通環(huán)節(jié)常用丁香酚作為麻醉劑[9]。

羅非魚(Oreochromismossambicus)屬熱帶魚類，因具有生長快、食性廣、繁殖力強、群體產量高、對環(huán)境適應力強、抗病力強和肉質細膩鮮美等特點，是聯合國糧農組織(FAO)向全世界推薦養(yǎng)殖的水產優(yōu)良品種，養(yǎng)殖區(qū)域已遍布85個國家和地區(qū)，成為國際上養(yǎng)殖最廣泛的魚類之一。受氣候與地理條件的影響，中國羅非魚養(yǎng)殖呈現明顯南多北少的現象。南方地區(qū)的廣東省、廣西壯族自治區(qū)、海南省、福建省及云南省得益于氣候條件，羅非魚養(yǎng)殖發(fā)展迅速，占據了全國產量的絕大部分。羅非魚大部分以鮮活運輸的方式銷往四川、新疆、北京及上海等地。對于商家來講，越是鮮活、質量好的水產品越能獲得更高的利潤，但在水產品的長途運輸過程中，生物易產生應激反應，而應激反應會引起水產品肉質的損傷，甚至導致死亡，死亡后的水產品從價值到口感都大打折扣。麻醉劑因具有鎮(zhèn)靜作用而被應用于水產品的?；钸\輸中。2013年，北京市某水產市場使用丁香油水門汀(含丁香酚)運輸活魚，經媒體曝光后引起廣泛關注[10]。由于缺乏丁香酚毒理學、藥理學及其藥物代謝動力學方面的研究，丁香酚是否可用和具體用量，其作為食物被麻醉后對人體產生的具體影響，已成為消費者關注的話題[11]。因此，急需開展丁香酚在羅非魚中的殘留檢測技術研究以及深入的藥物代謝動力學研究。

目前，關于魚、蝦、蟹和水體中丁香酚類化合物的檢測方法主要有高效液相色譜法[12-16]、氣相色譜法[17]、液相色譜-串聯質譜法[9,18-20]、氣相色譜-串聯質譜法[3,21-25]等。其中，高效液相色譜法和氣相色譜法在測定復雜基質樣品時，容易受干擾，且屬常量分析，檢測限高[12-17]。而色譜-串聯質譜聯用技術具有較高特異性，能較好地解決復雜基質樣品雜質干擾的問題，但采用氣相色譜-串聯質譜法，丁香酚會在96 h后降解[23]。現有研究多是集中在水產品肌肉中丁香酚殘留量的研究，其方法大多操作復雜、檢測耗時長，而對血漿中丁香酚的殘留檢測研究較少。且國內外暫未見采用UPLC-MS/MS對羅非魚血漿中丁香酚殘留檢測的研究。因此，本研究探討應用UPLC-MS/MS檢測羅非魚血漿中丁香酚的殘留；同時進一步優(yōu)化羅非魚肌肉中的丁香酚殘留檢測方法，旨在為完善水產品中丁香酚殘留檢測方法提供支持，也可為相關標準方法的制訂提供參考依據，保障羅非魚的食品安全。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器包括：超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(WatersTQ-XS)；Waters UPLC BEH C18色譜柱(50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)；HLB固相萃取柱(Waters Oasis 6CC，200 mg)；濾膜(有機相尼龍0.22 μm微孔濾膜)以及超純水機(美國Millipore公司)；離心機(美國Sigma公司)；旋渦振蕩器(德國IKA公司)；電子天平(德國Sartorius公司)等。

主要試劑包括：丁香酚標準品(外標物，純度≥98%，北京百靈威科技有限公司)；丁香酚-D3標準品(內標物，純度≥98%，美國Accustandard公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(美國Fisher公司)，正己烷為分析純(國藥集團化學試劑公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取10.0 mg丁香酚標準品，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成100.0 μg/mL的貯備液；經甲醇稀釋，配制成質量濃度為100 μg/L的標準中間液，存于-20 ℃冰箱(保存3個月內穩(wěn)定)。使用時用甲醇配制成不同濃度的標準工作液。

準確稱取2.0 mg丁香酚-D3(內標物)，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成0.2 mg/mL的內標貯備液，存于-20 ℃冰箱。使用時用甲醇稀釋成20 μg/L的標準工作液。

1.2.2 血漿前處理

用移液器準確移取400 μL血漿樣品，加入800 μL甲醇，渦旋混勻5 min，于13 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，進樣。

1.2.3 肌肉前處理[9]

將樣本打成勻漿，稱取2.00 g均質樣品于50 mL離心管中，加入20 μg/L丁香酚-D3內標物20 μL，加入5 mL正己烷，旋渦振蕩5 min后超聲10 min，以9 000 r/min離心5 min，轉移上清液，殘渣用5 mL正己烷按上述步驟重復提取1次，合并2次提取液，置于40 ℃水浴中，氮吹至近干，用3 mL 40%甲醇溶液復溶，9 000 r/min離心5 min，待上樣。

用4 mL甲醇和4 mL水，活化HLB固相萃取柱，上樣，用3 mL 40%甲醇溶液淋洗之后用4 mL甲醇洗脫，洗脫液過0.22 μm濾膜，上機。

1.2.4 液相色譜條件

采用Waters UPLC BEH C18色譜柱；進樣量5 μL；柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min。流動相A為0.1%氨水，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序為：0～0.5 min，25%B；0.5～2.5 min，25%B～95%B；2.5～3 min，95%B；3～4.5 min，95%B～25%B；4.5～5 min，25%B。

1.2.5 質譜條件

離子源為電噴霧離子源，負離子模式(ESI-)；多重反應監(jiān)測模式(MRM)；毛細管電壓1.48 kV，錐孔電壓29 V，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L/h，碰撞氣流速0.15 mL/min。多反應監(jiān)測離子對及條件見表1。

1.2.6 標準曲線的繪制

取6份空白樣品(血漿或肌肉)分別加入相應體積的標準溶液，配制成丁香酚含量分別為1.0、3.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/L的血漿樣品和1.0、3.0、5.0、10.0、50.0和90.0 μg/kg的肌肉樣品，分別按1.2.2及1.2.3方法對樣品處理后，計算血漿和肌肉的標準工作曲線回歸方程和相關系數。

1.2.7 檢出限與定量限確定

取空白血漿添加丁香酚標準溶液，按1.2.2方法處理；取空白肌肉添加丁香酚標準溶液和內標溶液，按1.2.3方法處理，每個濃度做6組平行試驗。

1.2.8 方法回收率與精密度測定

取空白血漿進行3個水平的添加，丁香酚的添加水平分別為2.0、4.0和20.0 μg/L，每個水平做6個平行樣品，按1.2.2方法處理；取空白肌肉進行3個水平的添加，丁香酚的添加水平分別為2.0、4.0和20.0 μg/kg，每個水平做6個平行樣品，按1.2.3方法處理，計算回收率和精密度。

表1 丁香酚的質譜多反應監(jiān)測離子對及質譜條件參數Tab.1 MRM ion pairs and mass spectral parameters for eugenol

注：其中“*”為定量離子。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 內標法和外標法的選擇

在實驗前期，參考相關文獻[15-16]，羅非魚血漿和肌肉的丁香酚含量均采用外標法來測定。預實驗發(fā)現，血漿前處理步驟簡單，只需提取和離心過濾，采用外標法加標試驗，丁香酚回收率即可大于97%，滿足檢測要求；而肌肉的前處理，由于需要過HLB固相萃取柱，會有部分丁香酚被淋洗，采用外標法加標試驗，其回收率只有70%左右。為了使實驗數據更加準確，參考相關內標法文獻[9,22]，本實驗重新建立了內標法，進行肌肉中丁香酚回收率實驗，發(fā)現回收率大于90%，滿足檢測要求。因此，本研究中確定分別以外標法和內標法測定羅非魚血漿和肌肉中的丁香酚殘留。

2.1.2 淋洗液濃度的優(yōu)化

在不加內標的情況下，分別比較了不同體積比的甲醇溶液淋洗效果(圖1)，結果顯示，當甲醇體積比低于40%時，不能有效淋洗基質，回收率較低；當甲醇體積比高于40%，可以有效去除丁香酚干擾基質，但同時隨著甲醇體積比的提高，丁香酚被洗脫的可能性也提高。因此，為了保證洗脫基質，同時保證丁香酚不被洗脫，本實驗選用40%甲醇溶液作為淋洗液。

圖1 不同體積比甲醇對回收率的影響(n=3)不同字母(a-c)之間差異顯著(P>0.05)。下同。Fig.1 Effects of different volume proportion of methanol on recovery rates(n=3)Significant difference in different letters(a-c，P<0.05).The same below.

2.1.3 洗脫液體積的優(yōu)化

取HLB固相萃取柱，活化后，添加50 μg/L的丁香酚標準溶液，經過淋洗后，用甲醇洗脫，每添加1 mL洗脫液收集一次，比較不同洗脫體積的回收率。結果顯示，1 mL的甲醇洗脫液可以洗脫出78%左右的丁香酚，在第4次1 mL洗脫時，丁香酚回收率達峰值，再次添加淋洗液回收率無顯著差異(P>0.05)。因此，確定使用洗脫液體積為4 mL(圖2)。

圖2 洗脫體積對回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of different elution volume on recovery rates(n=3)

2.1.4 色譜條件的優(yōu)化

為了使丁香酚色譜條件達到最佳，分別選取了BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50.0 mm)和HSS T3色譜柱(1.8 μm，2.1 mm×50.0 mm)進行實驗，結果顯示，HSS T3色譜柱峰形較差，峰較寬且為明顯的前沿峰；BEH C18色譜峰形尖銳，無拖尾，并和雜質峰有較好的分離。采用梯度洗脫程序，進一步考察對比了甲醇水、乙腈水、甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水4種不同流動相的分離情況。結果表明，甲醇水和乙腈水作為流動相時，丁香酚峰型差，靈敏度較低。而甲醇-0.1%氨水和乙腈-0.1%氨水作為流動相時，由于氨水的存在使丁香酚更易失去氫離子(H+)，離子化效率提高，靈敏度高。且相比之下，乙腈-0.1%氨水的靈敏度最高，和雜質分離效果最好，峰型最好。故本研究確定以乙腈-0.1%氨水作為流動相。

2.2 方法的線性、檢出限和定量限

在1.0～100.0 μg/L線性范圍內，丁香酚在羅非魚血漿中的線性方程及相關系數為Y=1 467X-272(r=0.998 5)；以3倍信噪比(S/N=3)計算得該方法檢出限為0.60 μg/L，以10倍信噪比(S/N=10)計算得該方法的定量限為2.0 μg/L。在1.0～90.0 μg/kg線性范圍內，丁香酚在羅非魚肌肉中的線性方程及相關系數為Y=0.015 4X-0.002 5(r=0.999 8)；以S/N=3計算得該方法檢出限為0.65 μg/kg，以S/N=10計算得該方法的定量限為2.0 μg/kg。

2.3 方法的回收率和精密度

羅非魚血漿3個添加水平(2.0、4.0和20.0 μg/L)的平均回收率為97.0%～98.9%，相對標準偏差為1.14%～2.21%；肌肉3個添加水平(2.0、4.0和20.0 μg/kg)的平均回收率為90.2%～95.9%，相對標準偏差為1.91%～5.28%(表2)。

表2 羅非魚血漿和肌肉中丁香酚的回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of the eugenol in muscle and plasma of tilapia n=6

3 討論

關于羅非魚血漿中丁香酚殘留的檢測，目前見報道的多為高效液相色譜法[16]測定，暫未見采用UPLC-MS/MS的檢測方法。孫宇航等[16]經乙酸乙酯、氨水和無水硫酸鈉提取，采用正己烷凈化的方法，建立了羅非魚血漿中丁香酚殘留檢測的高效液相色譜法，其方法檢出限為5.0 μg/kg。本研究建立了UPLC-MS/MS檢測羅非魚血漿中丁香酚殘留的方法，采用甲醇提取，高速離心后即可直接上機檢測，與HPLC法相比，其前處理方法簡單，靈敏度、準確度均較高。

目前已有學者采用UPLC-MS/MS測定水產品肌肉中丁香酚殘留的研究，如趙東豪等[9]采用正己烷提取，經UPLC-MS/MS測定，內標法定量的方法對魚類肌肉中丁香酚的殘留進行檢測，定量限為2.5 μg/kg。孫鵬等[18]針對河蟹、對蝦和鯉建立了漂浮固化分散液-液微萃取結合UPLC-MS/MS的方法測定丁香酚，定量限為4.91 μg/kg。倪崢飛等[19]建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析法，測定鯽、對蝦中4種丁香酚類麻醉劑殘留量，以外標法定量，結果表明，丁香酚定量限為2.5 μg/kg。而目前未見采用UPLC-MS/MS測定羅非魚肌肉中丁香酚殘留的研究報道。

在羅非魚肌肉中丁香酚的檢測研究方面，陳煥等[12,17,21]采用高效液相色譜法測定了羅非魚、南美白對蝦及鰻鱺中丁香酚類麻醉劑的殘留量，其定量限為50 μg/kg；采用GC-MS法同時測定羅非魚、南美白對蝦及扇貝中6中丁香酚類麻醉劑的殘留量，方法的定量限為1.0 μg/kg；采用分散固相萃取-氣相色譜法同時測定羅非魚、南美白對蝦、鰻鱺以及梭子蟹肌肉中6種丁香酚類麻醉劑的殘留量，方法的定量限為100 μg/kg。高平等[13]采用固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法測定了包括羅非魚在內的水產品中4種丁香酚類化合物，方法檢出限為3.0～6.0 μg/kg。黃武等[14]采用乙腈為提取溶劑，經超聲提取、正己烷脫脂凈化2次后，通過高效液相色譜技術檢測，外標法定量，建立了羅非魚中丁香酚殘留量的高效液相色譜分析方法，其的檢出限為0.03 mg/kg。孫宇航等[16]建立了羅非魚肌肉中丁香酚殘留檢測的高效液相色譜法，其方法檢出限為 5.0 μg/kg。

本研究中羅非魚肌肉中丁香酚殘留檢測方法與趙東豪等[9]的方法相似，均采用電噴霧離子源(ESI)負離子掃描，多反應監(jiān)測模式(MRM)測定，且均是以子離子m/z163>148作為定量離子，以m/z163>121作為第一定性離子，以m/z166>148作為丁香酚-D3內標離子峰。與趙東豪等[9]方法的不同之處在于樣品處理方法：本研究中，在采用正己烷提取的基礎上，增加了HLB固相萃取柱凈化過程，更有效地將分析物與干擾組分分離；且在上HLB柱之前，再次離心樣品，防止出現堵塞現象，提高了分析物的回收率；流動相改用乙腈-0.1%氨水，氨水使丁香酚更易失去H+，可提高樣品離子化效率及靈敏度。結果表明，本研究所建立的羅非魚肌肉丁香酚UPLC-MS/MS方法定量限可達2.0 μg/kg，較此前研究靈敏度略有提高。

本研究同時開展羅非魚血漿和肌肉中丁香酚殘留的研究，其中血漿前處理方法簡單，肌肉前處理較為繁瑣，在日常的監(jiān)督檢測中，建議取血漿抽檢，更加方便快捷，大大提高檢測效率。

4 結論

本研究建立了一種使用超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀檢測羅非魚血漿和肌肉中丁香酚殘留的方法，血漿和肌肉中丁香酚的定量限分別為2.0 μg/L和2.0 μg/kg。實驗結果表明，該方法具有靈敏度高、準確度好的特點，能夠滿足羅非魚血漿和肌肉中丁香酚的檢測要求，可為相關標準方法的制訂提供參考依據，為丁香酚在羅非魚體內的藥代動力學研究提供技術支持，為豐富和完善丁香酚在羅非魚體內的使用方法和休藥期的制訂提供基礎數據，同時為其他魚類血漿中丁香酚殘留檢測提供方法參考。