擬菱形藻軟骨藻酸產(chǎn)生影響因素及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王生福，楊傲傲，劉華雪，李修嶺，李偉斯，王士滿

(1. 臨沂農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，山東 臨沂276000； 2. 臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂276000； 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州510000； 4. 臨沂市環(huán)境監(jiān)測(cè)站， 山東 臨沂 276000； 5. 山東君成環(huán)境檢測(cè)有限公司， 山東 臨沂276000)

海洋環(huán)境尤其是海灣河口等近岸水域的污染加重及全球氣候變化異常，使得有害藻華現(xiàn)象頻發(fā)，成為突出的海洋生態(tài)災(zāi)害問(wèn)題。有害藻華的大規(guī)模暴發(fā)會(huì)對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)、海域生態(tài)安全以及人類和海洋生物的健康造成嚴(yán)重威脅[1-3]。硅藻是引起有害藻華暴發(fā)的重要類群，而擬菱形藻 (Pseudo-nitzschiaspp.)作為其中一類常見硅藻，其部分種類可產(chǎn)生強(qiáng)效神經(jīng)毒素即軟骨藻酸(domoic acid，DA)。最早公開報(bào)道的軟骨藻酸引發(fā)的中毒事件發(fā)生于1987年，加拿大愛(ài)德華王子島上發(fā)生因食用紫貽貝而造成人類誤食死亡事件[4]。隨后，由軟骨藻酸引發(fā)的水生生物及人類的中毒事件陸續(xù)涌現(xiàn)[5-7]。雖然中國(guó)至今尚未出現(xiàn)DA中毒事件的相關(guān)報(bào)道，但在一些濾食性海洋生物(如雙殼貝類、部分甲殼類)體內(nèi)常常能檢測(cè)到DA的存在，現(xiàn)已嚴(yán)重影響海產(chǎn)品的食用安全[8-10]，DA污染問(wèn)題不容忽視。為此，增加對(duì)DA生理和生態(tài)方面的研究，將有助于正確應(yīng)對(duì)、及時(shí)處理其可能引發(fā)的災(zāi)害問(wèn)題。目前，有關(guān)DA的研究已有較多報(bào)道，本文就DA的理化性質(zhì)、產(chǎn)生機(jī)理及其檢測(cè)分析等方面的進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期深入開展DA研究，更為科學(xué)合理地開發(fā)應(yīng)用DA。

1 DA的發(fā)現(xiàn)及理化性質(zhì)

DA是主要由擬菱形藻產(chǎn)生的一種神經(jīng)生物毒素，人類攝入后能夠引起記憶缺失性貝類中毒(amnesic shellfish toxins，AST或amnesic shellfish poisoning，ASP)。1958年，DA首次被Takemoto和Diago從日本的鹿兒島縣當(dāng)?shù)氐臉渲浌窃?Chondriaarmatadomoi)中發(fā)現(xiàn)，并以該藻的日文名(domic)命名[11]；1987年，DA首次于加拿大愛(ài)德華王子島的擬菱形藻中分離出來(lái)[12]。DA作為一種強(qiáng)神經(jīng)毒性物質(zhì)，人類誤食后，輕可引起腹痛、腹瀉及嘔吐現(xiàn)象，重則伴有記憶喪失、意識(shí)混亂等精神癥狀，甚至昏迷、死亡[7,13]。近年，擬菱形藻屬的種類數(shù)量不斷增多，在這些新發(fā)現(xiàn)的藻種中，某些藻種如巴西擬菱形藻(Pseudo-nitzschiabrasiliana)也能產(chǎn)生DA[14]。到目前為止，在已發(fā)現(xiàn)的45種擬菱形藻中，有26種確認(rèn)能夠產(chǎn)生DA[15]。圖1顯示的是DA從被發(fā)現(xiàn)到在世界沿海國(guó)家中擴(kuò)散的研究歷史進(jìn)程(縮略版)[16]，雖然中國(guó)尚未報(bào)道過(guò)DA中毒事件，但是中國(guó)沿海已檢測(cè)到多種產(chǎn)DA的擬菱形藻，包括尖刺擬菱形藻多列型(Psuedo-nitzschiapungensf.multiseries)、多列擬菱形藻(Pseudo-nitzschiamultiseries)、偽柔弱擬菱形藻(Pseudo-nitzschiasp.cf.Pseudodelicatissima)、成列擬菱形藻(Psuedo-nitzschiaseriata)和澳洲擬菱形藻(Pseudo-nitzschiaaustralis)等。因此，DA污染問(wèn)題仍存在潛在安全隱患[17-18]。

圖1 軟骨藻酸研究發(fā)展的歷史進(jìn)程[16]該歷史年表顯示了DA的發(fā)現(xiàn)歷史、分離及其在不同國(guó)家發(fā)現(xiàn)的DA中毒事件。其中縮略字母：JPN代表日本，USA代表美國(guó)，CAN代表加拿大，NZL代表新西蘭，IRL代表愛(ài)爾蘭，F(xiàn)RA代表法國(guó)，PRT代表葡萄牙，TUR代表土耳其，ITA代表意大利，SCO代表蘇格蘭，AUS代表澳大利亞，MYS代表馬來(lái)西亞。Fig.1 Research historical process of domoic acid[16]The timeline shows discovery, isolation and numerous domoic acid events across the global waters in various countries. JPN: Japan, USA: United States, CAN: Canada, NZL: New Zealand, IRL: Ireland, FRA: France, PRT: Portugal, TUR: Turkey, ITA: Italy,SCO: Scotland, AUS: Australia, and MYS: Malaysia.

軟骨藻酸，化學(xué)名稱為多莫酸，表示為[2S-[2α，3β，4β(1Z，3E，5R)]]-2-羧基-4-(5-羧基-1-甲基-1，3-己二烯)-3-吡咯烷乙酸，分子式為C15H21NO6，分子量為311.34，結(jié)構(gòu)式如圖2所示[5]。純品為白色固體粉末，熔點(diǎn)為223～224 ℃，可溶于水(8 mg/mL)，微溶于甲醇(0.6 mg/mL)。在紫外光譜區(qū)最大吸收波長(zhǎng)為242 nm，在體積比為 1∶9的乙腈-水溶液中，以及-12 ℃的黑暗條件下，DA可保持性質(zhì)穩(wěn)定的時(shí)間為1年左右[19]。DA的結(jié)構(gòu)在一定程度上與興奮性氨基酸谷氨酸(glutamic acid)和紅藻氨酸(kainic acid)類似，可以通過(guò)直接活化KA(kainate)受體和AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)受體介導(dǎo)興奮性神經(jīng)毒，從而引起神經(jīng)組織損傷[20-22]。但是其毒性效力比紅藻氨酸高出2～3倍，比谷氨酸作用強(qiáng)烈100多倍。近年來(lái)從某些藻類中又相繼分離出DA的同族化合物—異軟骨藻酸A、B、C、D、E及F等物質(zhì)，但這些物質(zhì)的毒性均弱于DA[23-24]。

圖2 軟骨藻酸化學(xué)式[16]Fig.2 Chemical structure of domoic acid[16]

2 影響DA產(chǎn)生的相關(guān)因素

目前，基于DA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中的基因功能注釋，有關(guān)DA合成途徑的研究已有初步結(jié)果，DA生物合成的第一步可能是在萜烯環(huán)化酶(terpene cyclase)的催化作用下，首先由香葉基焦磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)與L-谷氨酸(glutamic acid，L-Glu)的N-異戊烯化反應(yīng)生成N-香葉基-L-谷氨酸(N-geranyl-L-glutamic acid，L-NGG)，然后再在α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(a-ketoglutarate-dependent dioxygenase)和細(xì)胞色素P450催化完成后續(xù)的氧化反應(yīng)[25]。但有關(guān)DA產(chǎn)生的生物和生理生化分子機(jī)制仍未充分明確。值得一提的是，不論是不同藻種的擬菱形藻還是相同藻種的不同藻株，產(chǎn)毒能力均有所不同，即存在種間水平和種內(nèi)水平上的差異；此外，產(chǎn)毒能力還存在地理分布上的差異[26]。綜合現(xiàn)有的研究結(jié)果，擬菱形藻種類產(chǎn)毒與否、產(chǎn)毒水平高低與其藻種/藻株的種類、生理狀態(tài)及相關(guān)的生態(tài)因子以及環(huán)境因子密切相關(guān)。

2.1 藻種種類及生長(zhǎng)周期

不同藻種/藻株的擬菱形藻在不同生長(zhǎng)階段產(chǎn)生DA的能力不同。早期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多列擬菱形藻處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)幾乎沒(méi)有DA產(chǎn)生，在穩(wěn)定生長(zhǎng)期卻產(chǎn)生較多的DA[27]。有些種類則相反，如偽柔弱擬菱形藻和澳洲擬菱形藻，藻細(xì)胞內(nèi)DA的產(chǎn)量會(huì)在指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)逐漸增加，直至穩(wěn)定生長(zhǎng)期，最后DA被釋放進(jìn)入水體，引起水體DA含量的增加[28-29]。并且，相比營(yíng)養(yǎng)限制，指數(shù)生長(zhǎng)期會(huì)讓藻細(xì)胞產(chǎn)生最大凈DA產(chǎn)率[28]。而在培養(yǎng)從野外分離的4種擬菱形藻屬的藻株過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)所有藻株均在培養(yǎng)的第25天(穩(wěn)定生長(zhǎng)期)時(shí)檢測(cè)到了DA，且澳洲擬菱形藻產(chǎn)生的DA量遠(yuǎn)高于其他3種[30]?？梢缘弥?，相同培養(yǎng)環(huán)境下，不同藻種/藻株的擬菱形藻產(chǎn)生DA的能力不同；即使是同一藻種，DA產(chǎn)量也會(huì)因生長(zhǎng)環(huán)境的不同而產(chǎn)生生長(zhǎng)速率及細(xì)胞形態(tài)的變化[15]。

2.2 營(yíng)養(yǎng)元素

研究結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)鹽限制條件下，擬菱形藻的DA產(chǎn)量會(huì)明顯增加[31-32]。在所有的營(yíng)養(yǎng)鹽中，硅、氮和磷等元素對(duì)DA產(chǎn)量變化的影響最為顯著。

有研究表明，當(dāng)磷營(yíng)養(yǎng)限制時(shí)，成列擬菱形藻會(huì)產(chǎn)生DA；而當(dāng)處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞面臨硅營(yíng)養(yǎng)限制時(shí)，DA的產(chǎn)量會(huì)變得更多。與磷營(yíng)養(yǎng)限制相比較，硅營(yíng)養(yǎng)限制會(huì)更易產(chǎn)生大量的DA[33]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，DA合成基因的表達(dá)活性在磷營(yíng)養(yǎng)限制下發(fā)生顯著上調(diào)[25]。在硅或磷營(yíng)養(yǎng)限制條件下，DA的產(chǎn)量均能顯著增加，其原因可能是細(xì)胞能通過(guò)降低自身的基礎(chǔ)代謝活性，優(yōu)先促進(jìn)毒素合成基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了DA的產(chǎn)生[34]。當(dāng)硅元素不受限制時(shí)，如果培養(yǎng)液中的氮磷比較高，即磷元素含量較低，DA的產(chǎn)量也會(huì)增加。并且，當(dāng)其他基礎(chǔ)代謝(如碳、氮、磷和硅等吸收水平)降低時(shí)，DA的產(chǎn)量也會(huì)增加[35]。

氮源的含量及類型均會(huì)影響DA的產(chǎn)量。有研究表明，當(dāng)?shù)鳛榇罅吭卮嬖跁r(shí)，指數(shù)生長(zhǎng)期的尖細(xì)擬菱形藻(Pseudo-nitzschiacuspidata)細(xì)胞內(nèi)的DA含量會(huì)顯著高于穩(wěn)定生長(zhǎng)期時(shí)的DA含量[36]。而當(dāng)?shù)春肯嗤瑫r(shí)，通常情況下，有機(jī)氮較無(wú)機(jī)氮更能促進(jìn)藻類產(chǎn)生DA。例如，以尿素作為氮源時(shí)，相比于使用無(wú)機(jī)氮源，指數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞產(chǎn)生DA的量會(huì)顯著增加[37]。Martin-Jézéquel 等[38]通過(guò)對(duì)兩種擬菱形藻在有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源條件下產(chǎn)毒情況的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)多列擬菱形藻來(lái)說(shuō)，當(dāng)選取尿素作氮源時(shí)，DA產(chǎn)量最大；而對(duì)澳洲擬菱形藻而言，當(dāng)用谷氨酸鹽作氮源時(shí)，DA產(chǎn)量達(dá)到最大，此現(xiàn)象證實(shí)DA的產(chǎn)量與氮源類型有關(guān)，并且還會(huì)受到藻的種類的影響。但不同于先前研究結(jié)果的是，上述兩種藻均可在氮源不能持續(xù)大量供應(yīng)的情況下產(chǎn)生大量的DA[38]。

2.3 微量金屬

DA有可能是某些微量金屬元素如鐵、銅的螯合物，某些種類的擬菱形藻可通過(guò)產(chǎn)生DA而有選擇性地結(jié)合微量元素，從而增加自身必需微量元素的含量(如鐵)，或者是降低某些有毒的微量元素的含量(如銅)，所以DA的產(chǎn)生可能與海水中的鐵和銅離子的濃度密切相關(guān)[39]。

Maldonado等[40]通過(guò)研究多列擬菱形藻和澳洲擬菱形藻的DA產(chǎn)量與鐵、銅含量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)生長(zhǎng)期，胞內(nèi)和胞外的DA產(chǎn)量均會(huì)因鐵元素的缺乏或是銅元素的過(guò)量而升高。但在多列擬菱形藻的研究中，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)DA的產(chǎn)量會(huì)因鐵元素的增加而提高[15]。但胞外DA產(chǎn)量除與鐵元素含量有關(guān)外，還會(huì)因種群生長(zhǎng)階段的不同而存在差異，表現(xiàn)為在指數(shù)生長(zhǎng)期和衰退期時(shí)，鐵元素缺乏情況下有最大DA產(chǎn)量；而在穩(wěn)定生長(zhǎng)期時(shí)，結(jié)果與之相反[15]。鐵在細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程中，可能影響了某些電子傳遞反應(yīng)(如光合作用、呼吸作用)，進(jìn)而間接影響了DA的產(chǎn)生。

鋰作為一種被大家熟知的金屬元素，廣泛存在于土壤和水體中。鋰雖然不是藻細(xì)胞內(nèi)的必需元素，但它的存在卻能影響細(xì)胞的生理活動(dòng)[41]。在早期研究中發(fā)現(xiàn)，鋰與擬菱形藻的DA產(chǎn)量之間存在聯(lián)系，即高濃度的鋰可以明顯促進(jìn)DA的產(chǎn)生[42]。其原因可能是由于鋰具有較小的半徑和較高的極性，更易取代鈉離子、鉀離子等陽(yáng)離子，所以影響了質(zhì)膜內(nèi)離子泵的正常生理活動(dòng)；再者，鋰能與各類配體結(jié)合形成聚集體，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[41-43]。

2.4 溫度、光照

溫度和光照都是非常重要的環(huán)境生態(tài)因子，二者對(duì)DA產(chǎn)生的影響，可能是通過(guò)直接影響單個(gè)藻細(xì)胞的生理活性(如細(xì)胞內(nèi)的酶活性)或是間接影響藻細(xì)胞密度(如生長(zhǎng)速率)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，DA不僅會(huì)在營(yíng)養(yǎng)限制或是細(xì)胞狀態(tài)不好時(shí)產(chǎn)生，在特定溫度和光照狀態(tài)下其產(chǎn)量也會(huì)發(fā)生變化。如在澳洲擬菱形藻培養(yǎng)過(guò)程中，溫度和光照的相互作用能顯著影響 DA的產(chǎn)量[44]。

相同培養(yǎng)條件下，溫度對(duì)擬菱形藻產(chǎn)毒的影響會(huì)隨藻種的不同而不同。通常，溫度升高會(huì)促使更多DA的產(chǎn)生。比如成列擬菱形藻在4～15 ℃范圍內(nèi)[45]、多列擬菱形藻在5～25 ℃范圍內(nèi)[45]、澳洲擬菱形藻在23～30 ℃范圍內(nèi)，DA的產(chǎn)量會(huì)隨溫度的升高而有所增加[46]。值得注意的是，并非所有同種株系的藻類都表現(xiàn)如此。如在屬于多列擬菱形藻的Pm4株系培養(yǎng)過(guò)程中，特定溫度范圍內(nèi)，27 ℃時(shí)胞內(nèi)DA的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于18℃時(shí)的產(chǎn)量[47]。此情況可能是由于藻細(xì)胞生理和生態(tài)上不同的反應(yīng)機(jī)制導(dǎo)致。

光照可以通過(guò)光周期和光照強(qiáng)度的變化來(lái)影響藻類產(chǎn)生DA。如早期有研究發(fā)現(xiàn)，成列擬菱形藻在長(zhǎng)光周期(18 h光∶6 h暗)條件下，其DA總產(chǎn)量會(huì)顯著增加[48]。某些種類雖然在弱光條件下能連續(xù)產(chǎn)生DA，但是總體而言，強(qiáng)光條件下DA的產(chǎn)量會(huì)高于弱光條件下的產(chǎn)量。并且，強(qiáng)光條件下，DA產(chǎn)量會(huì)隨著光照強(qiáng)度的增加而增加[30,44]。光照能夠?qū)A產(chǎn)量產(chǎn)生影響可能是因?yàn)楣夂献饔脼榧?xì)胞提供了產(chǎn)生DA所需的能量。

2.5 細(xì)菌

單個(gè)細(xì)菌或細(xì)菌群落也會(huì)影響某種或某些擬菱形藻的產(chǎn)毒過(guò)程。如在對(duì)多列擬菱形藻的研究中發(fā)現(xiàn)，DA的產(chǎn)生與細(xì)菌存在與否密切相關(guān)[49-50]。早期研究表明，經(jīng)抗生素處理得到的藻細(xì)胞雖然生長(zhǎng)正常，但其產(chǎn)毒能力會(huì)比正常帶菌時(shí)降低8～10倍；而當(dāng)再加入原有細(xì)菌的單菌株時(shí)，DA產(chǎn)量會(huì)增長(zhǎng)2～95倍。也就是說(shuō)，胞外細(xì)菌的存在可以有效促進(jìn)DA的產(chǎn)量[49]。后期研究結(jié)果也證實(shí)了該觀點(diǎn)，即活細(xì)菌存在條件下，藻細(xì)胞中DA的產(chǎn)量會(huì)顯著高于無(wú)菌狀態(tài)下的藻細(xì)胞產(chǎn)量[50]。

但是，DA產(chǎn)量與細(xì)菌之間并非單一的對(duì)應(yīng)關(guān)系，還會(huì)因擬菱形藻產(chǎn)毒種類的不同而不同。比如非產(chǎn)毒的偽柔弱擬菱形藻，生理活性就不會(huì)因原有細(xì)菌缺失或外來(lái)細(xì)菌存在而受到影響，且始終不會(huì)產(chǎn)生DA；產(chǎn)毒的多列擬菱形藻則會(huì)在無(wú)菌條件下快速生長(zhǎng)繁殖，而在外來(lái)細(xì)菌共培養(yǎng)條件下則生長(zhǎng)緩慢且只產(chǎn)生少量的DA[51]。DA與細(xì)菌之間的影響是相互的，研究表明，DA的存在會(huì)在一定程度上影響細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)[52]。但擬菱形藻產(chǎn)毒種類與細(xì)菌的具體關(guān)系尚需進(jìn)一步深入研究。

2.6 其他因素

DA的產(chǎn)生，不僅受到營(yíng)養(yǎng)鹽、光照和溫度等因素的影響，還受到其他物質(zhì)及因子的影響。

1)粘土、鍺酸：早期研究中，俞志明等[53-54]發(fā)現(xiàn)粘土礦物和鍺酸均能抑制尖刺擬菱形藻產(chǎn)生DA，且鍺酸能在鍺/硅比值為35時(shí)，可完全抑制DA的產(chǎn)生。究其原因可能是，高濃度粘土影響了細(xì)胞的光合作用及營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)而影響了DA的產(chǎn)生；而鍺酸可能破壞了甚至中斷了細(xì)胞內(nèi)正常的硅化作用，破壞了藻細(xì)胞的呼吸作用、核酸和蛋白質(zhì)等化合物的合成過(guò)程，從而抑制了DA的產(chǎn)生。

2)pH：Lundholm等[45]發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，其他因素均不受影響的條件下，多列擬菱形藻在指數(shù)生長(zhǎng)期后期產(chǎn)生的DA量會(huì)隨著pH的增加(9.3～9.8)而顯著增加；而在野外實(shí)際觀測(cè)中，擬菱形藻暴發(fā)的赤潮水體往往有較高的pH(可以達(dá)到9甚至10左右)，推測(cè)擬菱形藻暴發(fā)水域可能會(huì)有大量DA產(chǎn)生。pH對(duì)DA產(chǎn)量的影響可能是通過(guò)影響酶作用過(guò)程或碳元素含量或金屬毒性作用或細(xì)菌結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)的(筆者認(rèn)為自然水體中的pH不易調(diào)節(jié)，主要還是依賴其生態(tài)系統(tǒng)自我修復(fù)；若是特定區(qū)域的水體，如魚池，有相關(guān)文獻(xiàn)介紹均衡pH的方法，但未提及DA)。因此，pH能夠影響DA產(chǎn)生，但DA是否會(huì)反向影響環(huán)境pH，尚需進(jìn)一步研究。

3)二氧化碳(CO2)：在兩種不同類型的擬菱形藻中，二氧化碳的增加能夠促進(jìn)DA的產(chǎn)生，尤其是當(dāng)環(huán)境中還存在磷營(yíng)養(yǎng)限制[55]或是硅營(yíng)養(yǎng)限制[56]。即使?fàn)I養(yǎng)鹽充足，有些藻類如多列擬菱形藻，細(xì)胞內(nèi)的DA產(chǎn)量也會(huì)因?yàn)槎趸嫉脑黾佣黾覽57]。胞內(nèi)DA合成基因的表達(dá)量會(huì)隨二氧化碳?jí)簭?qiáng)的增加而上調(diào)[25]。伴隨全球氣候變暖及海洋酸化現(xiàn)象，研究二氧化碳變化對(duì)藻類的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4)捕食者：有研究表明，在橈足類及哲水蚤類浮游動(dòng)物直接或間接存在的情況下，有毒硅藻(如成列擬菱形藻)的毒性會(huì)增加，說(shuō)明有毒硅藻可能通過(guò)產(chǎn)毒的方式來(lái)抵御被捕食[58]。對(duì)浮游動(dòng)物而言，在捕食產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒硅藻時(shí)并沒(méi)有明顯的選擇傾向，捕食攝入有毒硅藻后也并未對(duì)其自身產(chǎn)生明顯影響，所以浮游動(dòng)物更多的是作為一個(gè)載體，通過(guò)捕食有毒硅藻來(lái)間接地實(shí)現(xiàn)DA在海洋食物網(wǎng)中的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化[59-60]。

3 DA的檢測(cè)與分析

根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的不同，檢測(cè)方法可分為藻體DA濃度測(cè)定、水體DA濃度測(cè)定和貝類DA濃度測(cè)定。根據(jù)檢測(cè)方法的不同，又可分為生物、化學(xué)和物理檢測(cè)方法等，每一種檢測(cè)方法在使用時(shí)均有其各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性。本文對(duì)目前主要使用的檢測(cè)分析方法進(jìn)行介紹。

3.1 生物測(cè)定方法

小鼠生物測(cè)定方法(mouse bioassay，MBA)是檢測(cè)赤潮藻毒素的經(jīng)典方法，主要是通過(guò)一定年齡、大小和體重的小鼠來(lái)檢測(cè)藻毒素的毒性，最后用半致死劑量來(lái)評(píng)價(jià)毒性效應(yīng)。該方法最早于1987年用于DA的檢測(cè)，后續(xù)發(fā)現(xiàn)在使用時(shí)存在很多的不確定因素(如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大小、生理狀態(tài)、操作技術(shù)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間等)，且檢出限較高(適用于DA濃度在300～1 000 μg/g 的組織檢測(cè)[61])，還存在可重復(fù)性較差、操作時(shí)間較長(zhǎng)及無(wú)法區(qū)別毒素種類等缺陷，該方法已逐漸被新的檢測(cè)方法所取代[62]，但在毒理學(xué)研究中該方法仍有不可替代的作用。

3.2 高效液相色譜法

在液相色譜法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、氨基酸分析法和受體分析法等眾多方法中，雖然高效液相色譜法在使用時(shí)需要專業(yè)儀器且所需費(fèi)用相對(duì)較高，但由于其具有檢測(cè)快速、重復(fù)性好和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為是最有效的測(cè)定方法。高效液相色譜法對(duì)貝類毒素的分析中，最成功的是對(duì)DA的分析，已被多國(guó)列為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定使用反相高效液相色譜法對(duì)海產(chǎn)雙殼類及其制品(不包括鹽漬制品)進(jìn)行DA含量的檢測(cè)，該方法檢測(cè)限為1.0 μg[63-64]。

結(jié)合高效液相色譜法和其他的檢測(cè)手段，發(fā)展出一系列諸如高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(high performance liquid chromatography-ultraviolet，HPLC-UV)、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)和高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry，HPLC/ESI-MS)等新的檢測(cè)方法(表1)，在過(guò)去的20年里被用于測(cè)定貝類產(chǎn)品中DA的殘留[8-10,65-66]。

表1 HPLC各種方法的特征Tab.1 Characteristics of various HPLC methods

隨后，一些經(jīng)過(guò)優(yōu)化的 LC-MS 技術(shù)開始應(yīng)用于DA的檢測(cè)。比如，利用固相萃取法結(jié)合LC-MS技術(shù)可以在痕量水平(<1 pg/mL)對(duì)DA進(jìn)行檢測(cè)[67]；通過(guò)激光燒蝕電噴霧電離-高分辨率質(zhì)譜(laser ablation electrospray ionization-high resolution mass spectrometry，LAESI-HRMS)技術(shù)，能在鮮貝組織樣品中對(duì)5 μg/g的DA進(jìn)行檢測(cè)，該值是檢出限的1/4[68]；而高分辨率質(zhì)譜(high resolution-mass spectrometry，HRMS)結(jié)合超高壓液相色譜(ultra-high pressure liquid chromatography，UPLC)的液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(liquid chromatography-high resolution-mass spectrometry，LC-HRMS)技術(shù)，在尿樣中對(duì)DA的檢出限可達(dá)0.12 ng/mL[69]。

HPLC作為目前檢測(cè)DA最為成熟的技術(shù)，總體來(lái)說(shuō)對(duì)樣品的測(cè)定較穩(wěn)定，靈敏度較高，受操作和環(huán)境因素影響較小，但在測(cè)定效率、測(cè)定批量和成本方面等方面并不具優(yōu)勢(shì)。

3.3 酶聯(lián)免疫測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一類利用酶標(biāo)抗原和抗體特異性結(jié)合原理來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的分析方法，由于其具有方便快速、特異性強(qiáng)、檢出限低、易定性定量、無(wú)需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，已成為應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

ELISA 檢測(cè)法利用抗原-抗體反應(yīng)，采用特異性貝類毒素的抗體對(duì)DA進(jìn)行檢測(cè)和定量分析，其中使用多克隆抗體直接競(jìng)爭(zhēng)(direct competition of polyclonal antibody)、多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)(indirect competition of polyclonal antibody)以及單克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)(indirect competition of monoclonal antibody)檢測(cè)DA含量時(shí)，其檢出限能分別達(dá)到0.02[70]、0.15[71]和0.15[72]ng/mL。

ELISA檢測(cè)法靈敏度高，可用于DA的快速檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研制出多種針對(duì)DA檢測(cè)的ELISA方法及其試劑盒[73-77]。其中膠體金(colloidal gold)技術(shù)發(fā)展迅速，該項(xiàng)技術(shù)是通過(guò)標(biāo)記DA的單克隆抗體，利用競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，研制出膠體金免疫層析試紙條，從而進(jìn)行DA的檢測(cè)。國(guó)內(nèi)，高利利等[78]利用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金實(shí)現(xiàn)了15 min以內(nèi)、靈敏度為20 ng/mL的檢測(cè)方法；國(guó)外，Tsao等[79]利用從雜交瘤細(xì)胞系9F1F11中產(chǎn)生的單克隆抗體而制備的膠體金免疫層析試紙條，將DA的檢測(cè)時(shí)間縮短至10 min以內(nèi)、靈敏度提高到 5 ng/mL，真正實(shí)現(xiàn)DA的現(xiàn)場(chǎng)快速、批量檢測(cè)。

一些改良的ELISA技術(shù)已經(jīng)陸續(xù)出現(xiàn)并突顯出自身的優(yōu)勢(shì)，如基于毛細(xì)管電泳的酶免疫測(cè)定(capillary electrophoresis-based enzyme immunoassay，CEEIA)技術(shù)，可以在5 min內(nèi)通過(guò)電化學(xué)方法對(duì)貝類樣品中的DA進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度是傳統(tǒng) ELISA 技術(shù)的16倍[80]。此外，一項(xiàng)結(jié)合3種免疫學(xué)方法(固相微球法、流式熒光測(cè)定法和 Luminex xMap 技術(shù))的多功能檢測(cè)技術(shù)——流式細(xì)胞微球陣列術(shù)也被應(yīng)用于DA的檢測(cè)，半抑制濃度(IC50)可達(dá)到(1.9±0.1) ng/mL[81]。

盡管ELISA方法在使用中具有較多優(yōu)勢(shì)，但是昂貴的DA標(biāo)準(zhǔn)品、專業(yè)的酶標(biāo)儀等儀器、較小的DA分子量、復(fù)雜的免疫抗原制備技術(shù)以及難以操控的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)操作等，都在一定程度上限制了免疫方法在DA分析中的應(yīng)用。

3.4 DA其他檢測(cè)方法

除較常用的高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫測(cè)定等方法外，一些其他的檢測(cè)方法，如生物傳感器法、毛細(xì)管電泳法和神經(jīng)受體結(jié)合檢測(cè)等技術(shù)也被應(yīng)用于DA的檢測(cè)。

生物傳感器法是一種較為快捷且價(jià)格低廉的檢測(cè)技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)可以將生物反應(yīng)產(chǎn)生的信息轉(zhuǎn)化成可定量處理的電信號(hào)輸出，以此來(lái)測(cè)定物質(zhì)的濃度。在過(guò)去的20年里，各類基于生物傳感器的檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)污染物或是病原體的檢測(cè)中[82-83]。如在食品中，運(yùn)用表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)檢測(cè)DA時(shí)，所使用的高靈敏度的抗體—單克隆抗體和多克隆抗體，其半抑制濃度可分別達(dá)到4.8～6.9 ng/L和2.3～6.0 ng/L[84]。

毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis，CE)是利用不同的帶電粒子在電場(chǎng)中具有不同的遷移速率的原理實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的分離，該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低和易攜帶等特點(diǎn)，屬于較早應(yīng)用于海洋生物毒素分離和檢測(cè)的方法之一[85]。國(guó)內(nèi)在使用該種方法測(cè)定DA時(shí)，最低檢出限為34 ng/mL。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，其他的一些諸如純化和氨基官能化的銀納米粒子(pure or amino-functionalized Ag nanoparticles)和表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhanced raman scattering，SERS)等新型的DA檢測(cè)方法不斷出現(xiàn)，逐步實(shí)現(xiàn)不同情況下DA的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)[86]。但比較之下，以上方法在靈敏度和準(zhǔn)確度上還遠(yuǎn)不及色譜法和免疫學(xué)方法，所以應(yīng)用范圍仍十分有限。

4 展望

DA作為一種神經(jīng)毒素，一方面，會(huì)對(duì)水生生物和人類健康構(gòu)成潛在的風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，其具有殺蟲、殺菌的作用，因此對(duì)DA的研究具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，雖然國(guó)內(nèi)不斷有新的擬菱形藻被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，但是對(duì)DA及擬菱形藻屬研究仍十分有限，后續(xù)研究中除了需系統(tǒng)總結(jié)擬菱形藻在中國(guó)各個(gè)海域的分布情況、種類組成及產(chǎn)毒狀況外，本文認(rèn)為還需從以下3個(gè)方面加強(qiáng)科學(xué)探究。

1)加強(qiáng)對(duì)DA產(chǎn)生機(jī)制的研究，了解并掌握特定環(huán)境因子和生物因子對(duì)DA產(chǎn)生和分布的影響。目前，利用先進(jìn)的分子生物學(xué)和基因遺傳學(xué)手段，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與DA產(chǎn)生有關(guān)的上調(diào)/下調(diào)基因、參與DA合成的酶及可能的產(chǎn)生機(jī)制[25,87-88]。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)使用酶抑制劑、基因敲除或基因沉默等手段，或許可以增加或抑制藻類DA的產(chǎn)生。此外，還應(yīng)在有毒擬菱形藻屬中廣泛開展研究，而不是單純地針對(duì)某一種類如多列擬菱形藻，從而確保研究結(jié)果的通用性。

2)改進(jìn)DA的檢測(cè)手段和方法。隨著研究的深入，預(yù)期會(huì)有更多新的有毒赤潮藻及其藻毒素被發(fā)現(xiàn)和研究。目前，DA已經(jīng)存在多種檢測(cè)方法，但是使用中仍然存在著不同程度的局限性。高效液相色譜法具有檢測(cè)快速、重復(fù)性好和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為是目前最有效的測(cè)定方法。但近年來(lái)，ELISA檢測(cè)試劑盒因易于攜帶、可用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)而越發(fā)受到關(guān)注，一些快速檢測(cè)試紙條也正成為新的研究方向[78]。此外，通過(guò)DA的檢測(cè)，可以掌握DA的地理分布，通過(guò)建立合適的模型預(yù)測(cè)生態(tài)系統(tǒng)中DA的產(chǎn)生和遷移，從而預(yù)防潛在的DA災(zāi)害等。

3)進(jìn)一步探索DA的應(yīng)用前景。DA作為一種天然海洋藥物，比有機(jī)合成的化學(xué)藥劑有著更為明顯的優(yōu)勢(shì),如可以作為神經(jīng)生理學(xué)研究的重要材料。在預(yù)防DA毒性的同時(shí), 應(yīng)充分利用其生物活性，如利用DA對(duì)昆蟲的殺滅能力，開發(fā)新型滅蟲劑[5]。因此，根據(jù)DA的特性進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)是發(fā)展綠色產(chǎn)業(yè)的一條有效途徑。鑒于此，可以利用基因重組等手段篩選和培育DA高產(chǎn)藻株，以便進(jìn)行更為科學(xué)可控的DA生產(chǎn)與應(yīng)用。