基因修飾家兔研究進(jìn)展

薛 瑩 , 范江霖, 劉恩岐

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 西安 710061;2. 西安交通大學(xué)心血管研究中心, 西安 710061;3. 日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子病理學(xué)系, 日本山梨 409-3898)

家兔(Oryctolagus cuniculus)是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一, 由于其體型大小適中、繁殖周期短、容易進(jìn)行各種手術(shù)，因而被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究[1]。家兔對(duì)高膽固醇飲食敏感，是第一個(gè)用于研究人類動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型[2]。由于心臟肌原纖維蛋白(sarcomeric protein)組成與人類相似，家兔也用于研究人類心肌疾病發(fā)病機(jī)理[3]。與其他體型較大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如，豬、犬、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物)相比，家兔價(jià)格低廉，而且容易培育成無(wú)特定病原體(SPF)和近交系家兔。另外，家兔在進(jìn)化上比嚙齒類動(dòng)物更接近人類[4]，家兔也有足夠血容量(100～150 mL/成年兔)來(lái)完成多個(gè)生化分析和反復(fù)測(cè)試[1]。

自1980年起，基因修飾(genetically modified,GM)動(dòng)物研究和應(yīng)用發(fā)展迅速。1985年，首例利用顯微注射技術(shù)制作成功轉(zhuǎn)基因家兔[5]。然而，直到1990年代，才開始使用轉(zhuǎn)基因家兔研究脂蛋白代謝、動(dòng)脈粥樣硬化和肥厚性心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)等，GM家兔人類疾病模型進(jìn)入新時(shí)代[1]。

作為人類疾病動(dòng)物模型，GM家兔顯得尤為珍貴。因?yàn)榧彝檬墙橛谛⌒蛧X動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如，小鼠和大鼠)和大型哺乳動(dòng)物(如，犬和家畜)之間的重要物種，不僅可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來(lái)研究一些人類特定的疾病，而且可以作為生物反應(yīng)器(bioreactor)生產(chǎn)用于實(shí)驗(yàn)或醫(yī)藥工業(yè)的重組蛋白(recombinant proteins)[6]。

基于我們?cè)贕M家兔制作、應(yīng)用研究中一些體會(huì)，本文將簡(jiǎn)要描述GM家兔制作基本過(guò)程、討論GM家兔模型在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，以期為大家介紹GM家兔作為人類疾病模型最新進(jìn)展。

1 GM家兔培育歷史

GM動(dòng)物是指對(duì)動(dòng)物基因進(jìn)行人為修飾并且這種修飾可以穩(wěn)定遺傳的一類動(dòng)物品系，包括轉(zhuǎn)基因(transgenic)、基因敲除(knock-out, KO)、基因敲入(knock-in, KI)和敲低(knock-down)動(dòng)物。

1980年，Gordon等利用DNA顯微注射技術(shù)培育了世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠[7]。1985年，更大體型的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物(包括家兔、綿羊、豬)也被制作出來(lái)[5]。體型較大的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有特定的價(jià)值，不僅可以用作人類疾病動(dòng)物模型，還可以作為生物反應(yīng)器(如家兔、山羊、豬和牛)生產(chǎn)藥用重組蛋白[6]。1980年代后期，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地將一個(gè)突變體次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase)基因?qū)氲叫∈笈咛ジ杉?xì)胞(embryonic stem cell, ES細(xì)胞), 再將被修飾ES細(xì)胞注射到囊胚培育成功KO小鼠[8,9]。核糖核酸干擾(RNA interference, RNAi)是一種內(nèi)源性基因沉默機(jī)制, 通過(guò)雙鏈RNA序列介導(dǎo)mRNA降解原理，使用RNAi技術(shù)獲得ski基因敲低小鼠[10]，表型與KO小鼠類似，使得利用RNAi技術(shù)構(gòu)建基因敲低家兔成為可能。近年來(lái), 隨著鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription-activator like effector nucleases, TALENs)和RNA介導(dǎo)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9等基因操作技術(shù)的誕生, 為培育新一代KO家兔模型提供了新契機(jī)。已經(jīng)證實(shí), 利用ZFNs、TALENs技術(shù)、特別是CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)培育KO家兔模型是可行的。如,Flisikowska等[11]采用ZFNs技術(shù)敲除了家兔IgM, 賴良學(xué)課題組[12,13]用ZFNs、TALENs技術(shù)分別敲除了家兔apoCIII、RAG 1和RAG 2基因, 建立了一個(gè)高效CRISPR/Cas9系統(tǒng), 同時(shí)敲除了家兔CD36、LDLR, RyR2和apoE等4個(gè)基因[14]。

1985年，世界上第一例轉(zhuǎn)基因家兔模型培育成功，該轉(zhuǎn)基因家兔表達(dá)人生長(zhǎng)激素基因[5]。在開始培育GM家兔時(shí)，雖然蛋白質(zhì)表達(dá)水平低、外源基因無(wú)功能或作用，但這些最初研究卻為利用GM家兔作為替代模型研究人類疾病(如, 代謝疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、HCM等)奠定了基礎(chǔ)[15]。

2 GM家兔模型建立

2.1 轉(zhuǎn)基因家兔

常規(guī)轉(zhuǎn)基因家兔培育方法包括顯微注射法、轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞囊胚注射法、基因轉(zhuǎn)移到精子和卵母細(xì)胞、轉(zhuǎn)染體細(xì)胞核移植以及病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)等, 這些方法在我們以前的文獻(xiàn)已有詳細(xì)闡述[1,16],這里不再贅述。DNA原核顯微注射是制作轉(zhuǎn)基因家兔最成功、也最常用方法。

利用顯微注射方法制作轉(zhuǎn)基因家兔與同樣方法制作轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)程相似，差異之處在于家兔受精卵直徑約為小鼠受精卵的2倍，但原核大小相似，家兔受精卵有一個(gè)厚厚的透明帶，家兔細(xì)胞核對(duì)外源DNA的純度似乎更敏感[1]。轉(zhuǎn)基因家兔培育不僅耗時(shí), 而且受很多條件限制。首先, 外源DNA制備、供體胚胎產(chǎn)量、注射后胚胎存活率、妊娠率、產(chǎn)仔數(shù)等都是非常重要影響因素, 這些因素容易人為控制和改進(jìn)[17]。其次, 人們對(duì)轉(zhuǎn)基因家兔陽(yáng)性率、嵌合體(mosaic)、外源基因不表達(dá)以及異位表達(dá)(ectopic expression)缺乏足夠的了解, 影響制作效率[18]。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn), 通過(guò)原核顯微注射DNA培育轉(zhuǎn)基因家兔效率(轉(zhuǎn)基因仔兔數(shù)/總仔兔數(shù))在0.5%～5%[19-24]。也有人[25]提出雌、雄原核同時(shí)注射外源DNA可以增加轉(zhuǎn)基因兔的生產(chǎn)效率，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證?？傮w來(lái)說(shuō)，利用顯微注射方法制作轉(zhuǎn)基因家兔方法自誕生以來(lái)，沒有大的改進(jìn)，對(duì)影響家兔轉(zhuǎn)基因效率的因素缺乏系統(tǒng)研究[1]。

“睡美人”(sleeping beauty, SB)轉(zhuǎn)座子(transposons)是第一個(gè)證明能夠在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中有效換位的轉(zhuǎn)座子, SB轉(zhuǎn)座子基因傳遞具有許多優(yōu)點(diǎn),如，簡(jiǎn)單、安全、廉價(jià)、受體基因永久插入，還可以轉(zhuǎn)更大、更復(fù)雜的外源基因。SB轉(zhuǎn)座子原核顯微注射法成為轉(zhuǎn)基因家兔構(gòu)建的新方法[26]。

除了上述方法，也可通過(guò)精子介導(dǎo)法培育轉(zhuǎn)基因家兔[27-29]，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法也有報(bào)道[30]。精子和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移似乎比顯微注射更容易、更有效，但是，這些技術(shù)僅僅被應(yīng)用于方法驗(yàn)證上，在人類疾病GM家兔模型建立和研究上還未見其應(yīng)用。

2002年，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得第一只克隆家兔[31]，此后，李善剛等[32]也成功克隆了家兔，但克隆效率偏低，需要提高家兔核移植效率[33-35]，以利通過(guò)體細(xì)胞核移植培育轉(zhuǎn)基因和KO家兔[36-39]。

2.2 KO和KI家兔

1980年代初，由于ES細(xì)胞分離、培養(yǎng)成功，使得利用其制作KO動(dòng)物模型成為可能。ES細(xì)胞來(lái)自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有分化成各個(gè)組織的能力，但在體外可以保持不分化。根據(jù)同源重組的原理，利用分子生物學(xué)和組織培養(yǎng)技術(shù)可以定點(diǎn)敲除ES細(xì)胞中一個(gè)感興趣的基因，構(gòu)建一個(gè)修飾后的ES細(xì)胞，然后將ES細(xì)胞注入早期胚胎的囊胚腔中，胚胎移植，可以獲得嵌合體子代動(dòng)物。經(jīng)過(guò)修飾的ES細(xì)胞有可能分化成精子或卵子，修飾后的DNA則被傳遞到下一代[40]。1987年，KO小鼠培育成功[8]。小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬和牛等動(dòng)物的ES或ES樣細(xì)胞已經(jīng)分離培養(yǎng)成功，然而，除了小鼠和大鼠外，目前還沒有其他物種ES細(xì)胞可以穩(wěn)定傳代的報(bào)告，因此，利用ES細(xì)胞打靶突變培育KO動(dòng)物僅僅局限于小鼠。顯然, 依靠ES細(xì)胞獲得KO家兔是不可能的。1998年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制，稱為RNAi (RNA interference)。利用RNAi技術(shù)已經(jīng)成功培育基因敲低小鼠模型[10]，因此利用該技術(shù)制作基因敲低家兔模型理論上也是可行的[41]。

近年來(lái)，一些新的、具有劃時(shí)代意義的DNA編輯工具出現(xiàn)，可以完全不依賴于ES細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)基因特異性敲除。依靠特定核酸酶識(shí)別特定DNA序列，然后像“分子剪刀”(molecular scissors)一樣在動(dòng)物基因組中產(chǎn)生高效的雙鏈斷裂(doublestrand breaks, DSB), 使靶基因功能性消失或用于基因組DNA序列特定位點(diǎn)的整合。ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas9正是基于以上原理發(fā)展起來(lái)并帶來(lái)革命性變化的新技術(shù)[40,41]。

ZFNs由兩部分組成, 首先是3～6個(gè)Cys2-His2鋅指蛋白串聯(lián)組成的DNA識(shí)別域, 另一部分是非特異性的核酸內(nèi)切酶FokI的催化結(jié)構(gòu)域。通過(guò)DNA識(shí)別域識(shí)別特定DNA序列后將催化結(jié)構(gòu)域定位到目標(biāo)位點(diǎn)從而通過(guò)核酸內(nèi)切酶的作用切斷DNA形成雙鏈斷裂, 通過(guò)非同源末端連接(non homology end joining, NHEJ)進(jìn)行基因突變[41]。Flisikowska 等[11]設(shè)計(jì)了兩對(duì)針對(duì)家兔IgM外顯子1和2的ZFNs, 并將構(gòu)建好的ZFNs基因顯微注射到家兔受精卵原核，成功抑制了家兔IgM基因。Yang等[12]在研究中將ZFNs mRNA、家兔靶向apo-CIII基因注射于對(duì)家兔受精卵胞質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)ZFNs是產(chǎn)生KO家兔的有效方法。由于ZFNs采用較短的識(shí)別序列以及專利保護(hù)等導(dǎo)致ZFNs在靶序列選擇和應(yīng)用上受到限制。將效應(yīng)子蛋白與FokI核酸酶催化域融合表達(dá)產(chǎn)生TALENs，通過(guò)分別識(shí)別靶位點(diǎn)上下游序列兩條TALENs將其定位至特定基因靶位點(diǎn)，酶切產(chǎn)生DSB，誘發(fā)NHEJ導(dǎo)致基因插入或刪除突變，從而制作出KO動(dòng)物，是TALENs技術(shù)基本原理[41]。Song等[13]設(shè)計(jì)了一對(duì)針對(duì)家兔RAG基因第1、2外顯子TALENs, 通過(guò)胚胎顯微注射TALENs mRNA，成功地獲得RAG KO家兔模型。CRISPR位點(diǎn)是由一串連續(xù)排列的短指向性重復(fù)序列中間夾雜一些短間隔序列(spacer), CRISPR通過(guò)產(chǎn)生RNA(CRISPR-derived RNA, crRNA)與CRISPR-associated protein(CRISPR/Cas9)相結(jié)合形成識(shí)別催化結(jié)構(gòu)，可識(shí)別基因組特定DNA序列并切除?；贑RISPR/Cas9原理，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了一套用于GM編輯的工具，利用single guide RNA(sgRNA)代替互補(bǔ)的crRNA，與Cas9一起發(fā)揮作用產(chǎn)生DSB。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究者已經(jīng)成功在多種哺乳動(dòng)物(包括非人靈長(zhǎng)類)中實(shí)現(xiàn)了基因突變, 在Cas9和gRNA共同作用下成功誘導(dǎo)特異性DNA識(shí)別、產(chǎn)生DSB、誘導(dǎo)NHEJ發(fā)生[41]。Yang等[14]利用該技術(shù)同時(shí)敲除4個(gè)基因位點(diǎn)(CD36，LDLR，RyR2，apoE)，是使用CRISPR/Cas9構(gòu)建KO家兔的第一例成功報(bào)道。

CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs在制作KO動(dòng)物效率上差距并不明顯，但CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)更加簡(jiǎn)單、高效，成為動(dòng)物基因編輯最常用工具，而ZFNs和TALENs鮮有應(yīng)用[40]。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)雖然提高了KO及定點(diǎn)修飾(如，定點(diǎn)突變、基因插入)的效率, 但是基于同源重組機(jī)制的基因定點(diǎn)突變效率仍然較低。2016 年, Komor等[42]報(bào)告了一種新的單堿基編輯系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)可以在不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂的情況下，利用sgRNA將 Cas9-胞嘧啶脫氨酶-尿嘧啶糖基化酶抑制子三者構(gòu)成的融合蛋白，sgRNA 通過(guò)與靶位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)，引導(dǎo)融合蛋白結(jié)合到靶位點(diǎn)發(fā)揮作用。融合蛋白中的胞嘧啶脫氨酶能夠使非互補(bǔ)鏈中相應(yīng)的胞嘧啶C經(jīng)脫氨基作用轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，而 DNA復(fù)制進(jìn)一步使得U被T代替，而互補(bǔ)鏈上原來(lái)與C互補(bǔ)的堿基鳥嘌呤G將會(huì)變成腺嘌呤A，而尿嘧啶糖基化酶抑制子則能夠抑制U的切除，最終實(shí)現(xiàn)非互補(bǔ)鏈上的C替換為T和互補(bǔ)鏈上G替換為A的精確編輯。基于該技術(shù)，賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)[43]建立了一個(gè)高效單堿基編輯系統(tǒng)，在國(guó)際上率先在家兔上改變單個(gè)堿基, 精確地模擬出人類單堿基突變遺傳病中的無(wú)義突變、錯(cuò)義突變和RNA錯(cuò)誤剪切, 成功培育出白化病、早衰癥、雙肌臀等疾病模型兔。

很顯然，得益于新近發(fā)展的DNA編輯技術(shù)(特別是CRISPR/Cas9)，不依靠ES細(xì)胞也可以輕易制作KO、KI家兔模型，用于生物醫(yī)學(xué)研究。可以預(yù)見，在不久的將來(lái)，依靠這些新技術(shù)，組織特異性KO家兔模型也將培育成功，大大豐富GM家兔模型資源。

3 GM家兔在心血管研究中應(yīng)用

采用我們?cè)?jīng)使用的檢索策略[15], 我們發(fā)現(xiàn)從1985年開始, 每年發(fā)表的GM家兔相關(guān)論文數(shù)量一直在增加, 上世紀(jì)末、本世紀(jì)初達(dá)到高峰, 近年來(lái)略有下降(圖1)。GM家兔主要應(yīng)用領(lǐng)域集中在生化分子生物學(xué)和心血管系統(tǒng)(圖2)。下面簡(jiǎn)要介紹一下在GM家兔作為人類疾病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展。

圖1 不同年齡GM家兔相關(guān)論文數(shù)量

因?yàn)镵O、KI家兔模型培育成功歷史相對(duì)較短，目前GM家兔在生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用成果大多數(shù)來(lái)自轉(zhuǎn)基因家兔模型。

全世界每年死亡人數(shù)的30%是由于心血管疾病(cardiovascular vascular disease, CVD)，我國(guó)CVD病死亡率更是世界平均水平的1.5倍，是危害人類健康名副其實(shí)的第一殺手[44]。CVD病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，脂代謝異?？梢饎?dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展[45]。因此，研究動(dòng)脈粥樣硬化、脂代謝對(duì)預(yù)防和治療人類CVD有重要意義。

3.1 脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化

利用轉(zhuǎn)基因家兔模型開展人類相關(guān)疾病研究起始于1994年，F(xiàn)an等[47]報(bào)道了家兔過(guò)表達(dá)人肝酯酶(hepatic lipase, HL)影響血脂和動(dòng)脈粥樣硬化以來(lái)，過(guò)表達(dá)人類15-lipoxyenase、ABCG 1、apo(a)、apoA-I、apoA-II、apoB-100、apoC-III、apoE2、apoE3、CETP、CRP、LCAT、LPL、MMP-12、PLTP、VEGF、U-II以及過(guò)表達(dá)家兔apoB mRNA編輯蛋白等基因的轉(zhuǎn)基因家兔模型相繼培育成功。通過(guò)雜交育種技術(shù), 已成功將人類apo(a)、LCAT、LPL、MMP-12等基因轉(zhuǎn)移到低密度脂蛋白(LDL)受體缺陷的家族性高脂血癥(Watanabe heritable hyperlipidemic, WHHL)家兔背景下。此外，雙表達(dá)人HL和apoE、apo(a)和apoB、HL和apoB基因的雙轉(zhuǎn)基因家兔及同時(shí)表達(dá)apoA-I/C-III/A-IV的3個(gè)基因轉(zhuǎn)基因家兔模型也培育成功，用于研究這些基因在人類脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用。

圖2 GM家兔不同應(yīng)用領(lǐng)域論文數(shù)量

轉(zhuǎn)基因家兔模型在解析以上基因在脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化作用做出了重要貢獻(xiàn)，由于篇幅限制，具體每個(gè)GM家兔貢獻(xiàn)和相應(yīng)文獻(xiàn)可參照我們已發(fā)表相關(guān)綜述[1,46,47]。

3.2 心臟病

在心臟病研究方面，兩個(gè)研究小組[48,49]分別構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家兔模型來(lái)研究心血管生理、模擬HCM。其中一個(gè)研究小組構(gòu)建了β肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, MyHC)缺陷的轉(zhuǎn)基因兔模型，發(fā)現(xiàn)其表型與表達(dá)人類MyHC突變型患者幾乎相同：心肌肥大、肌細(xì)胞和肌原纖維排列紊亂、間質(zhì)纖維化、過(guò)早死亡。MyHC轉(zhuǎn)基因家兔模型也被用來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)HCM和心肌纖維化影響[48,50-54]。另一個(gè)小組的James等使用小鼠α和β MyHC作為啟動(dòng)子、制作了過(guò)表達(dá)肌球蛋白輕鏈突變體(m149v)的轉(zhuǎn)基因家兔, 來(lái)探討這種突變與HCM關(guān)系[49,55]。最近，該研究小組[55-60]還構(gòu)建了在心室表達(dá)心肌肌鈣蛋白I(cTnI-146Gly)、α-MyHC、心臟G蛋白α(GSα)等轉(zhuǎn)基因家兔模型研究人類心臟衰竭。cTnI-146Gly轉(zhuǎn)基因家兔再現(xiàn)了人HCM表型[56]，α-MyHC轉(zhuǎn)基因家兔肌原纖維蛋白異樣[57,58]，GSα轉(zhuǎn)基因家兔心率加快、收縮增強(qiáng)[59,60]。此外，Brunner等[61-63]成功構(gòu)建表達(dá)人類鉀通道突變基因KCNQ1和KCNH2轉(zhuǎn)基因家兔，表現(xiàn)長(zhǎng)心室復(fù)極延長(zhǎng)(QT)綜合征表型。

3.3 其它領(lǐng)域

除了CVD以外，GM家兔在免疫學(xué)研究中也有重要應(yīng)用。如，家兔對(duì)HIV-1感染敏感、但進(jìn)程緩慢，主要是由于人類和家兔CD4結(jié)合位點(diǎn)的病毒蛋白HIV gp20不同，有鑒于此，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立了表達(dá)人CD4轉(zhuǎn)基因家兔模型，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于CD4轉(zhuǎn)基因家兔淋巴細(xì)胞感染HIV-1后容易凋亡，表明用轉(zhuǎn)基因家兔模型研究HIV可行[64-66]。此外，基于新一代基因編輯技術(shù)，免疫缺陷家兔模型也已經(jīng)培育成功[4]，拓展了GM家兔模型在免疫、腫瘤等的應(yīng)用，也為未來(lái)人類腫瘤預(yù)防、診斷和治療提供了獨(dú)特的模型。

從圖2可以看出，GM家兔模型在生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用極其廣泛，這里不再贅述。另外，轉(zhuǎn)基因家兔模型可以成為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)或醫(yī)藥工業(yè)用重組蛋白，家兔具有小動(dòng)物(小鼠、大鼠)和大動(dòng)物(山羊、綿羊、牛)無(wú)法比擬的優(yōu)越性，該領(lǐng)域不屬于人類疾病動(dòng)物模型范疇，故這里也不作詳細(xì)討論，有興趣讀者可閱讀我們相關(guān)綜述[6]。

4 家兔與小鼠

家兔脂蛋白代謝和心血管特性與人類相似，而與生物醫(yī)學(xué)研究中使用最廣泛的小鼠模型不同：①家兔與人類脂蛋白譜(低密度脂蛋白豐富)相似，與小鼠(高密度脂蛋白豐富)不同; ②家兔的肝臟不能編碼apoB48 mRNA，像人的肝臟一樣只能合成apoB2100，而小鼠肝臟既能產(chǎn)生apoB2100, 又可以合成apoB48。因此，小鼠的apoB48既存在于肝源性極低密度脂蛋白中, 也存在于腸源性乳糜微粒之中，而人類的apoB48只存在于人的乳糜微粒之中;③家兔與人類血漿中有豐富膽固醇脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而小鼠缺乏固醇脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; ④膽固醇飲食可以容易誘導(dǎo)家兔動(dòng)脈粥樣硬化，而大多數(shù)小鼠品系對(duì)此抵抗; ⑤與小鼠相比，家兔缺乏與人相似的apoA-II且具有較低的HL的活性[41,46]。家兔與小鼠的以上差異，暗示在研究脂蛋白代謝與動(dòng)脈粥樣硬化方面，家兔是一個(gè)獨(dú)特的動(dòng)物模型。

家兔也是心臟病研究獨(dú)特的模型： ①與小鼠相比, 家兔心臟體積較大和心率緩慢，更利于清醒狀態(tài)下的生理分析(如, 超聲、心臟導(dǎo)管插入); ②人類和家兔間肌原纖維蛋白的相似性高。如, β-MyHC蛋白是人和家兔心室肌細(xì)胞主要亞型，超過(guò)肌原纖維中肌球蛋白總數(shù)80%，而α-MyHC是小鼠亞型，超過(guò)95%; ③與家兔和人類心臟相比, 小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的正收縮-頻率關(guān)系(positive force-frequency relationship); ④家兔β腎上腺素能受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子變化與人類心衰患者相似[40,41]。

動(dòng)物物種間表型差異、同種動(dòng)物個(gè)體差異受遺傳背景和環(huán)境因素雙重影響。即使同一GM的家兔和小鼠模型，因其遺傳背景不同，表型也可能不同。如，過(guò)表達(dá)人LCAT家兔具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用、而在小鼠卻促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化[67,68]; 轉(zhuǎn)基因小鼠LPL高表達(dá)引起肌病(myopathies)，家兔則不出現(xiàn)疾病[69,70]; ctTnI-146Gly轉(zhuǎn)基因家兔心肌肥厚，轉(zhuǎn)基因小鼠卻不出現(xiàn)心肌肥厚[56,71]?？赡苁怯捎诩彝弥鞍状x、心血管特性與小鼠不同，基因?qū)牒罂赡墚a(chǎn)生不同甚至完全相反的表型。因此，對(duì)于研究諸如動(dòng)脈粥樣硬化、心臟衰竭、HCM、肥胖、糖尿病等復(fù)雜的疾病發(fā)病機(jī)理，尋找預(yù)防或治療策略時(shí)，家兔模型可能是小鼠模型重要補(bǔ)充，因?yàn)榧彝媚Ｐ涂赡芨朴谌祟悘?fù)雜的生理狀況(如，脂代謝和心血管特征)。再如, 我們知道心血管疾病的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，而動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)慢性炎癥過(guò)程[45]。最新研究[72]表明，小鼠炎癥反應(yīng)過(guò)程與人類不同，提示單純使用小鼠模型研究人類炎癥性疾病可能有缺陷。也許，家兔模型正好可以彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。

當(dāng)然，GM家兔模型制作和應(yīng)用也有一些不足之處(主要是家兔這個(gè)物種本身造成)，如，SPF和近交系家兔模型不常見、沒有廣泛使用; 構(gòu)建和維持GM家兔需要更高成本; 解析GM家兔模型表型需要花費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間; 條件性KO家兔和“工具”家兔制作和維持成本高；缺乏種類足夠多抗體用于組織學(xué)和分子生物學(xué)研究；缺乏精細(xì)家兔基因組序列信息(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/316?genome_assembly_id=203429）。還有，家兔是草食性動(dòng)物，食性特征與人不一致; 高脂飼料誘導(dǎo)和WHHL等家兔動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生部位與人不一致[73];誘導(dǎo)家兔心肌梗死和腦梗模型困難; 等等，限制了家兔或GM家兔模型在生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用。

5 展望

GM家兔在研究人類疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有獨(dú)特的、小鼠無(wú)法替代的作用，特別是在研究人類諸如高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、免疫學(xué)、腫瘤等復(fù)雜疾病方面，GM家兔模型為探討其發(fā)病的分子機(jī)制開辟了新的途徑。經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，GM家兔為我們認(rèn)識(shí)許多人類疾病做出了寶貴的貢獻(xiàn)。

動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)重大缺陷是外源基因整合位點(diǎn)的隨機(jī)性, 相對(duì)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)而言, 基因打靶(包括KO、KI和基因敲低)是研究基因功能更強(qiáng)大的手段。隨著ZFNs、TALENs, 特別是CRISPR/Cas9等新的基因編輯技術(shù)的出現(xiàn), 給家兔基因打靶帶來(lái)了重大突破。隨著這些新技術(shù)不斷改進(jìn)和優(yōu)化, 更多、更新、更精確的GM基因家兔模型將會(huì)產(chǎn)生。不編碼蛋白質(zhì)的小RNA(microRNA, miRNA)，或是長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)也將被引入到GM家兔研究中，培育miRNA或lncRNA KO或KI家兔將成為可能。此外，使用新GM技術(shù)可以建立擬人化家兔模型，將會(huì)使對(duì)人類疾病的研究更加深入。我們相信，未來(lái)GM家兔將成為生物醫(yī)學(xué)研究不可或缺的動(dòng)物模型，必將為研究人類疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、尋找切實(shí)可行預(yù)防、診斷和治療措施提供幫助。