應(yīng)用于行為學(xué)研究中八臂迷宮實驗方法的改良

劉 波, 王 楊, 李志杰

(1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心, 沈陽 110004;2. 遼寧省環(huán)境與代謝疾病動物模型研究與應(yīng)用重點實驗室, 沈陽 110004;3. 遼寧省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科, 沈陽 110042)

八臂迷宮是一種研究動物空間記憶的迷宮模型，主要用于不同藥物處理以及疾病模型下動物學(xué)習(xí)、記憶、覓食策略、空間認(rèn)知等多方面的研究[1]。它由八邊形中央?yún)^(qū)和與其連接的八條工作臂組成。實驗者通過在特定食餌臂末端放入食餌作為對進入該臂的獎賞，而在其余臂內(nèi)不放食餌或通過刺激手段懲罰實驗動物的方式對實驗動物進行迷宮覓食訓(xùn)練。動物在饑餓驅(qū)使下探索迷宮尋找食餌，通過一定時間的訓(xùn)練后，可對迷宮各臂進行自由探索并成功躲避沒有食餌的工作臂完成覓食。通過水，電等刺激-應(yīng)答模塊建立完整的條件、非條件環(huán)境刺激，配合視頻采集系統(tǒng)記錄實驗動物覓食或逃避策略，提供靈敏且易于操作的技術(shù)以分析不同藥物處理或疾病模型損傷對記憶相關(guān)腦區(qū)的影響，用于評估發(fā)育神經(jīng)損傷處理對嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知的影響[2]。

目前大多文獻采用的傳統(tǒng)八臂迷宮實驗方法在實際操作中的訓(xùn)練周期長達(dá)2～4周。實驗動物成功躲避無誘餌臂端快速找到食餌臂端概率較低，且單次探索時間長或是訓(xùn)練次數(shù)過多，不能在短時間合理訓(xùn)練頻率下有效評估空間學(xué)習(xí)記憶能力，無法方便服務(wù)于實驗者快速有效完成實驗[2]。為此本實驗應(yīng)用改良電加熱條件刺激八臂迷宮裝置探索新型八臂迷宮實驗方法。

1 材料與方法

1.1 動物

選取清潔級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(200±10)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供[SCXK(遼)2015-0001], 隨機分為2組, 對照組10只按照傳統(tǒng)八臂迷宮方法進行訓(xùn)練，實驗組10只按照改良方法進行訓(xùn)練。實驗開始前一周所有大鼠開始控制攝食量，每日定時投喂飼料10 g/只，控制體質(zhì)量保持在原體質(zhì)量的80%～85%，飲水不限[SYXK(遼)2017-0004]。并于固定時間對將要進行實驗的大鼠實施撫摸安撫以適應(yīng)環(huán)境，并于實驗開始前禁食12h。

1.2 儀器設(shè)備

視頻追蹤系統(tǒng)： Ethovision XT 小動物視頻軌跡行為學(xué)分析系統(tǒng)，購自荷蘭Noldus公司; 箱體： 標(biāo)準(zhǔn)大鼠八臂迷宮箱體，尺寸為單臂長425 mm，寬145 mm，高225 mm，購自北京眾實科技有限公司; 獎勵食餌： 經(jīng)60Co輻照滅菌的市售生瓜子仁; 懲罰裝置： 4個電輔熱裝置，尺寸100 mm×100 mm，購自江蘇省東臺市正龍電熱電器廠; 參考物： 各臂內(nèi)貼不同形狀參考物(以加強實驗過程中動物對周圍環(huán)境的記憶)。

1.3 實驗方法

第1日：讓大鼠適應(yīng)迷宮環(huán)境。將禁食12 h的2組大鼠隨機各再分為5組，每組2只。將迷宮閘門同時打開并在各臂末端及中央?yún)^(qū)域各投放5個瓜子仁作為食餌，2只大鼠同時放入迷宮中央?yún)^(qū)域, 讓其自由攝食、探究10 min，每日訓(xùn)練2次。以大鼠后肢完全進入臂門記為進入該臂1次。

第2日：重復(fù)第1日的訓(xùn)練。實驗人員于訓(xùn)練開始前輕柔安撫動物5～10 min，使其放松地自由探索迷宮環(huán)境。

第3日：迷宮及食餌位置保持不變，每只大鼠單獨進入迷宮訓(xùn)練，使其大膽?yīng)氉蕴剿髅詫m環(huán)境。每只鼠在單次訓(xùn)練結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%酒精噴灑擦拭箱體以去除氣味滯留。

第4日：為對照組大鼠設(shè)定特定食餌臂以及空食餌臂，例如1號動物食餌臂1，3，5，6; 空食餌臂為2，4，7，8。實驗組大鼠設(shè)定固定食餌臂及電加熱懲罰臂，例如： 1號動物食餌臂為2，4，5，8; 電加熱懲罰臂為1，3，6，7。在每個食餌臂投放1顆瓜子仁作為食餌。電加熱懲罰裝置溫度設(shè)定為60 ℃。電加熱懲罰臂末只放置電加熱裝置而不放食餌。實驗者將大鼠輕柔地放入至八臂迷宮中央，適應(yīng)環(huán)境30 s后同時打開閘門讓其自由探究直至吃完食餌或總探索時間達(dá)10 min結(jié)束訓(xùn)練，每日訓(xùn)練2次。

第5至第7日；重復(fù)第4日的訓(xùn)練。

第8日：連接視頻軌跡跟蹤采集系統(tǒng)，設(shè)定大鼠編號及采集信息，只在對應(yīng)編號的食餌臂放置1顆瓜子仁作為食餌，而在其他臂中不做任何處理。每只鼠在實驗結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇噴灑擦拭箱體以去除氣味滯留。實驗者輕柔地將大鼠放置于迷宮中央，適應(yīng)環(huán)境30 s后同時打開閘門并開始記錄其自由探究運動軌跡。軟件分析2組大鼠移動距離、移動速度、總體耗時、參考記憶錯誤以及工作記憶錯誤等實驗指標(biāo)，以評估兩種方法對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶探索能力。工作記憶錯誤(working memory errors)，即在同一次實驗中大鼠再次進入已經(jīng)吃過食餌的臂; 參考記憶錯誤(reference memory errors), 即在一次實驗中動物進入非食餌臂。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 平均移動距離、探索時間和移動速度

分析第8日采集的視頻軌跡可知，與對照組相比，實驗組完成實驗的平均移動距離和平均探索時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而平均移動速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表1)，表明本實驗中使用的加熱裝置不會對其運動能力造成影響。

2.2 參考記憶錯誤和工作記憶錯誤百分比

分析2組大鼠第8日采集視頻軌跡可知，與對照組相比，實驗組完成實驗的參考記憶錯誤百分比存在極顯著差異(P＜0.01)且小于15%達(dá)到訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)。而工作記憶錯誤百分比無顯著差異(P＞0.05)(表2)。

2.3 第7日訓(xùn)練結(jié)果

在訓(xùn)練第7日，2組大鼠均能在10 min內(nèi)成功完成探索任務(wù)。但對照組大鼠完成探索所需時間明顯長于實驗組。

表1 平均移動距離、探索時間和移動速度

表2 探索過程的參考記憶錯誤和工作記憶錯誤百分比

2.4 運動軌跡圖

通過視頻軌跡跟蹤系統(tǒng)軌跡(圖1)可見，對照組大鼠在傳統(tǒng)方式訓(xùn)練7 d后無法達(dá)到八臂迷宮實驗追蹤測試標(biāo)準(zhǔn)，而實驗組大鼠在改良實驗方法訓(xùn)練7日后均達(dá)到八臂迷宮實驗追蹤測試標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 兩組實驗動物運動軌跡圖

3 討論

八臂迷宮又稱放射性迷宮，該裝置已廣泛應(yīng)用于檢測藥物作用或疾病模型損傷下嚙齒類動物大腦空間學(xué)習(xí)記憶能力[3]。八臂迷宮實驗準(zhǔn)確敏感地反映腦空間學(xué)習(xí)記憶功能，使其成為檢測嚙齒類動物空間記憶的重要實驗方法之一。空間記憶又分為參考記憶和工作記憶。工作記憶屬于程序性記憶范疇，是在皮層-紋狀體系統(tǒng)調(diào)控下完成的對進行中工作任務(wù)的重要信息的短期存儲；參考記憶則是空間定位物體本身以及物體與食餌的相對關(guān)系[4]。海馬結(jié)構(gòu)在短期記憶向長期記憶轉(zhuǎn)變和空間學(xué)習(xí)記憶功能中發(fā)揮至關(guān)重要作用[5]。

實驗者可通過分析實驗動物運動軌跡參數(shù)，客觀反映實驗動物在不同處理條件下特定腦區(qū)空間分離記憶能力[6]。然而參考國內(nèi)外諸多文獻[2,3,11]表明，八臂迷宮實驗操作目前沒有標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的工作流程。想要達(dá)到最終追蹤測試標(biāo)準(zhǔn)即工作記憶錯誤和參考記憶錯誤均小于15%，通常需要2～4周甚至更長時間。本實驗中，對照組大鼠在訓(xùn)練7d后雖然能在10 min內(nèi)完成實驗探索，但參考記憶錯誤(平均值41.56%)遠(yuǎn)超15%的要求。證明傳統(tǒng)訓(xùn)練方式無法在7 d內(nèi)使大鼠達(dá)到最終測試標(biāo)準(zhǔn)。所以非常需要有針對大鼠行為特點的新型訓(xùn)練設(shè)備和相對規(guī)范的操作流程。

本實驗創(chuàng)新性采用在無食餌臂增加電加熱設(shè)備刺激大鼠足底的改良八臂迷宮實驗方案。并且通過實驗證明相對于傳統(tǒng)方法，此方案能在連續(xù)7 d的訓(xùn)練過程中使大鼠在八臂迷宮中快速準(zhǔn)確完成覓食活動。實驗結(jié)果對比中表明，兩組大鼠均能對陌生的八臂迷宮環(huán)境進行自主探索覓食。在分析覓食策略中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用改良實驗方法在相同訓(xùn)練時間內(nèi)能顯著縮短覓食運動平均移動距離和探索時間, 更好體現(xiàn)動物進化中優(yōu)先選擇食餌策略。分析兩組大鼠平均運動速度可知，改良實驗中60 ℃的足底熱刺激對大鼠運動能力無明顯影響。證明相對于其他水、光、電強刺激, 合理溫度的熱刺激更能降低受試動物的應(yīng)激概率，以免出現(xiàn)實驗動物因過于恐懼停止探索或強刺激作用下的恐懼情緒對空間記憶形成影響等所致實驗失敗現(xiàn)象[2]。除此之外，與對照組相比，實驗組大鼠參考記憶錯誤百分比有極顯著降低，證明改良實驗方法有利于增強大鼠對食餌臂和非食餌臂空間記憶。有趣的是, 兩組實驗結(jié)果中工作記憶錯誤百分比無統(tǒng)計學(xué)意義，提示改良實驗方法對實驗動物短時記憶無顯著影響, 再次表明此方案中的熱刺激條件不會造成實驗動物的應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，本實驗采用改良電加熱八臂迷宮設(shè)備配合參考諸多國內(nèi)外權(quán)威文獻及多次實驗的改進，形成的實驗操作流程能在訓(xùn)練7 d后完成檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的八臂迷宮實驗。相比于傳統(tǒng)實驗方法，改良迷宮設(shè)備造價低廉，價格優(yōu)勢明顯，且操作流程簡單易學(xué)，并能顯著縮短迷宮訓(xùn)練周期，為更好評價實驗動物空間分離記憶功能檢測提供新方案。